Microscopie dispersion optique basé sur des filtres de Gabor bidimensionnelle

Dans cette vidéo, la microscopie de diffusion optique est utilisée pour quantifier la fragmentation mitochondriale durant l'apoptose. Bien que la microscopie de diffusion optique n'exige habituellement pas de fluorescence dans ce protocole, des images fluorescentes seront acquises à des fins de validation. Après la mise en place du système d'imagerie, les cellules sont marquées avec le traceur MIT vert et traitées avec de la strosyorine afin d'induire l'apoptose.

Les données optiques sont acquises afin de détecter des changements dans l'orientation des organites cellulaires au cours des deux heures suivant l'observation. Le début de la fragmentation mitochondriale peut être mesuré à l'aide des données de diffusion optique, qui montrent une diminution du degré d'orientation des particules subcellulaires. Ces données sont ensuite validées en corrélant les données de diffusion optique avec les régions fluorescentes contenant des mitochondries.

Bonjour, je suis Nada Bustani du Laboratoire de bio-optique du Département de génie biomédical de l'Université Rutgers. Je suis Rob Pak du Laboratoire de bio-optique, et je suis Deen, également du Laboratoire de bio-optique. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de quantifier les dynamiques morphologiques subcellulaires à l'aide d'une méthode qui ne repose pas sur des colorants fluorescents.

Nous utilisons cette technique dans notre laboratoire pour étudier les changements dynamiques de la structure subcellulaire durant l'apoptose ou la mort cellulaire programmée. Commençons donc. Commencez cette procédure en stérilisant les mains gantées avec de l'éthanol à 70 %.

Ensuite, placez une solution mère préparée à 100 nanomolaire de Miot Tracker Green et le milieu de culture de cellules BAEC préchauffé sous la hotte avec la lumière éteinte, et stérilisez toutes les surfaces. Placez ensuite une boîte de culture de six puits contenant des cellules ensemencées sur un lamelle sous la hotte. À l’aide d’une pipette Pasteur reliée à une ligne de vide.

Retirez le milieu cellulaire des puits. Ajoutez ensuite immédiatement deux millilitres du milieu marqué dans chaque puits pour marquer les cellules.Mitochondries. Couvrez la plaque de culture tissulaire afin d'éviter l'exposition à la lumière ambiante directe et replacez rapidement les cellules dans l'incubateur.

Incuber pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius pendant que les cellules incubent. Préparez d'abord le dispositif optique en allumant la lampe à arc au mercure. Ensuite, allumez les caméras du microscope et de l'ordinateur, branchez le laser, puis branchez le dispositif micro-miroir numérique ou DMD et le diffuseur rotatif.

Ensuite, observez à travers l'oculaire du microscope pour vérifier si le lancement optique est aligné. Le champ de vision doit être uniformément éclairé par la lumière laser. Pour charger l'échantillon, déposez une à deux petites gouttes d'huile à immersion sur un objectif à immersion huileuse de 63 x, celui-ci étant complètement abaissé.

Ensuite, placez sur la platine une lame constituée d'une grille de lignes espacées régulièrement de 10 micromètres appelée gradi, puis remontez l'objectif afin que l'huile l'attrape au point de focalisation. Ensuite, focalisez le bord hexagonal du champ du condenseur. Arrêtez lorsque celui-ci est aligné avec l'éclairage de Köhler central.

Le bord hexagonal doit être centré dans l'oculaire et nettement mis au point. Ensuite, à l'aide des boutons de position du diaphragme de champ du condenseur, centrer le diaphragme de champ sur le champ de vision. Démarrer le logiciel IP et saisir les paramètres pour faire fonctionner la caméra.

Vérifiez que la caméra est réglée en mode transfert d'image. Exécutez la commande d'acquisition de mise au point pour démarrer l'aperçu en direct. Ensuite, définissez le préfixe d'index et l'emplacement du fichier où les images seront enregistrées.

Ensuite, lancez l'image RS. Définissez les paramètres pour faire fonctionner la caméra Cool Snap. Le mode d'horloge doit être réglé sur normal.

Démarrez le logiciel DMD. Placez le diaphragme de champ sombre dans le menu script. Cliquez ensuite sur charger et réinitialiser.

Pour exécuter le script manuellement, régler la barre optiv du microscope dans la fenêtre sur LSM. Cela enverra l'image à travers le DMD dans les optiques alignées. Projection de l'image en champ sombre sur le CCD de la caméra Cascade five 12.

L'image en champ sombre doit apparaître dans l'aperçu en direct dans IP lab. Si nécessaire, faites la mise au point sur l'aperçu en direct. Réglez le temps d'exposition suffisamment élevé pour garantir au moins 10 000 signaux dans l'image.

Ensuite, prenez une capture de l'objet observé à l'aide de la commande d'acquisition unique après l'acquisition. Utilisez la commande « enregistrer en tant qu'indexé » pour sauvegarder l'image sur le disque. L'image du GTI mesure la taille de l'objet observé.

Déplacez maintenant l'échantillon GTI de manière à ce qu'il soit hors du champ de vision, ne laissant apparaître que le fond. Capturez une image du fond avec un temps d'exposition suffisant pour acquérir au moins 5 000 comptes. Cette image permettra la soustraction du fond dans les images non filtrées.

Maintenant, pour acquérir des images filtrées par Gabor du fond, chargez le script de banque de filtres de Gabor dans le logiciel de contrôle du DMD. Exécutez l'intégralité du script pour transférer les filtres dans la mémoire embarquée du DMD. Cela peut prendre quelques minutes une fois que l'ensemble du script est transféré.

Utilisez les marqueurs de début et de fin dans le logiciel DMD pour vous assurer qu’un seul ensemble de filtres correspondant à un filtre de type Gabor est chargé à la fois. Exécutez le script pour acquérir des images filtrées du fond. L’aperçu en direct de l’image doit passer du champ sombre à l’image filtrée.

Pour ce filtre, ouvrez le script d'acquisition dans IP Lab à partir du disque. Ajustez le temps d'exposition afin d'obtenir au moins 2000 comptes. Pendant l'exécution du script DMD, annulez l'aperçu en direct dans IP Lab et exécutez le script d'acquisition.

Cela acquerra automatiquement l'index et enregistrera l'image filtrée sur le disque. Une fois la première image acquise, arrêtez l'exécution du script dans DMD. Supprimez les commandes utilisées du script.

Remplacez ensuite les marqueurs de début et de fin au début et à la fin du prochain jeu de filtres. Répétez l'acquisition dans le laboratoire IP jusqu'à ce que l'ensemble de la banque de filtres ait été utilisée et que toutes les images filtrées aient été acquises et sauvegardées. Préparez-vous à ensemencer les cellules en branchant un fer à souder sur le plan de travail du laboratoire et en chauffant le milieu L 15 à 37 degrés Celsius.

Préparez un poste de travail avec une serviette en papier et une lingette Kim pour absorber tout milieu renversé et maintenir la zone propre. Préparez plusieurs mèches en déchirant et en torsadant des lingettes Kim. Les mèches serviront à faire passer le liquide à travers la plaque cellulaire.

Ensuite, utilisez le porte-échantillon métallique pour créer un sandwich à cellule. À l’aide d’une seringue, appliquez un fin cordon de graisse à vide autour de la périphérie supérieure du trou dans la plaque métallique usinée, en allant jusqu’à environ la moitié des extrémités des rainures de chaque côté. Faites glisser délicatement une lame de couverture propre de numéro un sur la graisse.

Retournez la plaque et appliquez la graisse autour du trou. Éteignez les lumières de la pièce en portant des gants d'examen NI stérilisés à l'éthanol. Récupérez les cellules à partir de l'incubateur.

Retirer la lame de verre qui sera utilisée pour l'expérience de la plaque à six puits. Sécher soigneusement la lame de verre. Ensuite, appuyer la lame de verre, côté cellules vers le bas, sur la plaque métallique graissée, au-dessus du trou d'observation.

Placer les cellules entre les plaques. Veiller à ce qu'aucun espace d'air ne subsiste et à ce que la graisse ait formé un joint étanche afin de permettre la mise en place du milieu. Retourner ensuite la plaque et pipeter 200 microlitres à la fois.

Ajouter le milieu L 15 préchauffé dans le sandwich par la rainure située entre la lame supérieure et la plaque métallique jusqu'à ce que le liquide atteigne presque la rainure située de l'autre côté. Ensuite, laver les cellules en plaçant une mèche sur la rainure opposée et en pipettant 200 microlitres supplémentaires de milieu dans le sandwich. Le milieu circulera d'un côté à l'autre tandis que la mèche éliminera l'ancien milieu.

Veillez à éviter la formation de bulles dans le liquide pendant cette étape. Répétez ce processus deux à trois fois en utilisant une mèche neuve pour chaque rinçage. Retournez ensuite la plaque une fois de plus en la soutenant par les bords afin de piéger le liquide dans le réservoir de la cellule.

Trempez le fer à souder dans le bécher de veap pour faire fondre rapidement une petite quantité de veap, qui adhérera alors à la pointe du fer à souder. À l’aide de la pointe du fer à souder, appliquez soigneusement le veap fondu autour des bords du couvre-objet inférieur. Continuez à plonger et à appliquer tout autour du périmètre du couvre-objet afin de le sceller sur la plaque métallique.

Cela crée un bon joint mécanique afin que la lamelle ne se détache pas de la plaque lors de l'observation. Nettoyez tout résidu présent sur la face inférieure. Nettoyez la surface de la lamelle en utilisant un essuie-tout roulé en boule pour essuyer la lamelle.

Faites glisser d'un seul mouvement continu afin de garantir que la lame couvre est la plus propre au centre, là où elle sera observée. Replacez la plaque à six puits dans l'incubateur. Emportez les cellules ensemencées au laboratoire d'optique et montez-les sur l'objectif.

Comme précédemment, repérez un champ de cellules en bon état et acquérez une image en champ sombre du champ de vision. Ensuite, alignez le microscope en contraste de phase interférentiel (DIC) et vérifiez que les temps d'exposition sont adéquats. Acquérez une image DIC à l'aide d'une caméra cascade.

Dans ce dispositif, les images fluorescentes sont acquises à l’aide de la caméra cool SNAP tandis que le microscope est encore aligné en contraste de phase interférentiel (DIC). Régler le variateur (VAR) du microscope sur 1x et le champ de vision à 100 % en vision binoculaire, puis détourner l’image des oculaires vers la caméra. Placer une LED bleue au-dessus du condenseur pour éclairer le champ.

Ensuite, prévisualisez le champ de vision dans l'image RSS et ajustez le foyer finement. Si nécessaire, acquérez une image DIC et enregistrez-la sur le disque. Remarquez comment le champ de vision diffère de celui obtenu avec la caméra en cascade.

Ces images devront être alignées lors de la phase d'analyse de l'expérience. Ensuite, placez le cube de filtres fluorescent en position et acquérez une image en fluorescence en activant brièvement l'excitation fluorescente à l'aide du volet du microscope, puis désactivez-la dès que l'acquisition est terminée. Pour minimiser le photoblanchiment, enregistrez l'image en fluorescence sur le disque.

Pour acquérir des images filtrées, réinitialisez le microscope sur le champ et dirigez la lumière à travers le port LSM. Comme précédemment, exécutez intégralement le script de la banque de filtres de Gabor pour terminer l'acquisition des données pour un point temporel, les cellules étant encore sur la platine et sans perturber le champ de vision. Utilisez la méthode par capillarité pour remplacer le milieu L 15 ordinaire par le même milieu contenant une solution de STS à une micromolaire.

Au cours de l'expérience, ajoutez du milieu supplémentaire pour éviter le dessèchement, en pipetant le milieu dans la rainure de la plaque à cellules sans la retirer de la platine ni perturber le champ de vision. Répétez maintenant ces étapes pour les points temporels suivants jusqu'à la fin de l'expérience. Les données recueillies comprendront un grand nombre d'images filtrées qui devront être traitées afin d'extraire les données relatives à la structure subcellulaire.

Ici, deux expériences exemples sont présentées. Cette figure montre des images séquentielles d'un échantillon d'algue diatomée marine. Les structures orientées sont clairement visibles.

Dans l'imagerie en champ sombre. Les images optiquement filtrées, étiquetées de cinq égal à zéro degré à cinq égal à 160 degrés, sont présentées aux côtés de l'image non filtrée de l'échantillon. À des fins de comparaison, l'ensemble des neuf images filtrées de Gabor du diatomée a été traité pixel par pixel pour déterminer l'orientation de l'objet.

Pour chaque pixel, le signal maximal a été divisé par le signal moyen en fonction de l'orientation du filtre afin d'obtenir une valeur de rapport d'aspect. Ici, un rapport d'aspect proche de un, indiqué en bleu, est présent dans les zones où il n'existe aucun angle de réponse privilégié. Des valeurs plus élevées, indiquées en rouge, indiquent des zones où une réponse à un angle privilégié plus marquée est présente.

La luminosité et la signification du code de la réponse totale du filtre GABOR, ainsi que l'orientation du filtre, donnent le signal maximal à chaque pixel, ce qui correspond à la direction perpendiculaire à l'orientation de l'objet sous-jacent. L'orientation des particules de la sous-structure est codée dans un diagramme de flèches (quiver plot), où chaque ligne correspond étroitement à l'orientation locale de l'objet visible sur l'image en champ sombre non filtrée. Le diagramme de flèches montre l'orientation des objets dont les intensités de réponse sont supérieures à 10 % du maximum.

Ces images en champ sombre et filtrées optiquement d'un champ contenaient des cellules endothéliales bovines vivantes ; des images filtrées ont ensuite été acquises toutes les 20 minutes pendant une période de trois heures après traitement avec l'inducteur de l'apoptose, la sporisorine. Ici, la carte du rapport d'aspect dans le panneau supérieur et l'imagerie en fluorescence des mitochondries dans le panneau inférieur sont présentées en fonction du temps. La teinte colorée représente le degré d'orientation ; comme précédemment, ces courbes temporelles comparent la diminution du degré d'orientation du rapport d'aspect des particules dans les cellules endothéliales traitées avec la sporisorine, les tracés individuels représentant des courbes temporelles obtenues au sein de cellules individuelles.

L'orientation des gouttelettes est limitée aux régions des cellules qui correspondent aux zones fluorescentes. Désormais, la validation par rapport à la fluorescence a été réalisée. Elle devient archivée.

Ainsi, dans les prochaines expériences, les mesures mitochondriales peuvent être effectuées en omettant les étapes d'imagerie par fluorescence et en utilisant directement la méthode de diffusion optique. Nous venons de vous montrer comment surveiller la fragmentation mitochondriale durant l'apoptose à l'aide de signatures de diffusion de la lumière basées sur des filtres de Gabor. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de bien préparer le mode de vie et de s'assurer que le dispositif optique est correctement aligné et calibré.

Alors, mettons un peu de sens dans l'observation et la collaboration avec des expériences d'interface utilisateur.