Préparation des échantillons MALDI: la méthode de la couche ultra mince
29 avril 2007
Cette vidéo montre la préparation d'un ultra-mince de matrice / analyte couche pour analyser des peptides et des protéines par Matrix-Assisted Laser Désorption Ionisation Mass Spectrometry (MALDI-MS).
Bienvenue dans le tutoriel du laboratoire CHI sur la méthode de la couche ultrafine, particulièrement utile pour la détermination précise de la masse des protéines. En raison de la sensibilité de la spectrométrie de masse, nous n'utilisons que des réactifs de qualité HPLC ainsi que des gants en latex ou en nitrile sans poudre pour nettoyer la plaque. Rincez alternativement avec du méthanol, de l'eau, puis à nouveau du méthanol.
Entre chaque rinçage, essuyez délicatement l'excès de solvant à l'aide d'un papier-lentille. Vous pouvez répéter ces étapes de lavage autant de fois que nécessaire pour obtenir une plaque propre. Une fois la plaque nettoyée et sèche, elle doit être utilisée immédiatement.
Appliquez et répartissez 20 à 30 microlitres de solution de substrat en couche mince sur la plaque MALDI propre. Ici, nous utilisons une pipette P2-50 pour répartir uniformément la solution tout en évitant de rayer la plaque. Au fur et à mesure que la couche mince sèche, retirez les gouttelettes d'eau résiduelles éventuelles en tamponnant délicatement avec un essuie-tout.
Ensuite, essuyez délicatement la plaque d'un seul mouvement uniforme avec un essuie-tout Kim pour former correctement la couche mince. Enfin, nettoyez les bords de la plaque afin d'éviter de contaminer le spectromètre de masse. Il est essentiel de tester la couche mince avant d'appliquer votre échantillon.
Si la tache-témoin met trop de temps à sécher là où les cristaux ne sont pas homogènes, le problème peut provenir de la couche mince elle-même ou de la solution matricielle ; nettoyez la plaque, réappliquez la couche mince, puis refaites le test. Lors du dépôt sur la couche mince, vous ne devez pas laisser vos taches s'évaporer jusqu'à séchage complet. Au contraire, une fois que la cristallisation a ralenti et cessé, retirez le solvant en excès.
À l'aide d'un aspirateur sous vide, la présence de contaminants tels que les sels et les détergents, ainsi qu'une concentration élevée de l'analyte, peut interférer avec la cristallisation. Une dilution supplémentaire de l'échantillon pourrait améliorer la cristallisation. Repérez les fourmis en proximité immédiate de l'échantillon. Cela permettra une calibration pseudo-interne au cours de laquelle la plaque est déplacée du point d'échantillon au point d'étalonnage.
Lors de l'acquisition de l'échantillon, l'ajout de quelques tirs laser du CAS au spectre garantit un calibrage de masse plus précis qu'un calibrage externe seul. Il est très important d'éliminer par lavage toute contamination pouvant interférer avec l'ionisation de l'analyte, telle que le sel ou les détergents. Pour ce faire, déposez directement sur les points des gouttes d'acide trifluoroacétique à 0,1 % dans de l'eau HPLC glacée.
Retirer la solution de lavage à l’aide d’un aspirateur à vide, comme illustré ici. Cette méthode produit d’excellents spectres aussi bien pour les protéines membranaires que pour les protéines solubles.
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Aperçu
Ce vidéo montre la préparation d'une couche ultra-fine de matrice/analyte pour l'analyse de peptides et de protéines par spectrométrie de masse avec désorption/ionisation assistée par laser et matrice (MALDI-MS). Cette méthode est essentielle pour la détermination précise de la masse des protéines.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Spectrométrie de masse
- Analyse des protéines
- Chimie analytique
Contexte
- La spectrométrie de masse est une technique sensible pour l'analyse des biomolécules.
- La préparation de la plaque d'échantillonnage est cruciale pour obtenir des résultats précis.
- Des réactifs de qualité HPLC sont recommandés pour le nettoyage.
- Des techniques appropriées de manipulation et de nettoyage améliorent la qualité de l'analyse.
Objectif de l'étude
- Démontrer la méthode de la couche ultra-mince pour la spectrométrie de masse MALDI.
- Garantir une détermination précise de la masse des protéines.
- Fournir un tutoriel sur les meilleures pratiques en matière de préparation des échantillons.
Méthodes utilisées
- Utilisation de réactifs de qualité HPLC.
- Nettoyage de la plaque avec du méthanol et de l'eau.
- Élimination du solvant en excès avec un papier optique.
- Utilisation immédiate de la plaque nettoyée pour l'analyse.
Résultats principaux
- Démontré des méthodes de nettoyage efficaces pour la plaque d'échantillon.
- Mis en évidence l'importance d'utiliser des matériaux appropriés.
- Montré les étapes de préparation d'une couche ultramince.
- Fourni des informations sur le maintien de l'intégrité de l'échantillon.
Conclusions
- La méthode de la couche ultra-mince est essentielle pour une spectrométrie de masse précise.
- Les techniques adéquates de nettoyage et de préparation sont indispensables.
- Le respect des meilleures pratiques peut améliorer considérablement les résultats de l'analyse.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La détermination précise de la masse des protéines est essentielle pour la validation des cibles et l'identification des composés candidats en phase précoce de découverte. La méthode de préparation d'échantillons MALDI en couche ultra-mince améliore la qualité des données en augmentant la tolérance aux impuretés et l'uniformité spatiale, ce qui permet une évaluation fiable des composés. Cette méthode confère une confiance prédictive dans la caractérisation des protéines, réduisant ainsi l'ambiguïté mécanistique dans le choix des modèles précliniques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet une détermination précise de la masse des protéines, soutenant l'analyse des hypothèses thérapeutiques et la validation fonctionnelle des cibles.
- Valeur opérationnelle : Offre une tolérance accrue aux sels et aux détergents, réduisant les faux négatifs dans les échantillons sensibles aux impuretés.
- Valeur prédictive : Améliore la résolution et l'uniformité spatiale, renforçant la confiance dans l'identité des protéines et leur état de modification.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Produit des spectres de haute qualité et reproductibles, essentiels à la standardisation des dosages et à la cohérence des mesures quantitatives.
- Valeur opérationnelle : Utilise des étapes simples et robustes, compatibles avec des environnements de criblage à haut débit.
- Extensibilité : Permet la préparation de plaques d'échantillons validées pour des flux de travail en aval, favorisant la réutilisation de la plateforme dans différents projets.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Permet l'analyse des protéines membranaires et solubles, facilitant la caractérisation de systèmes pertinents pour les maladies.
- Réduction des risques mécanistiques : Facilite la détermination précise de la masse de protéines aux plages de masse étendues (jusqu'à 380 kDa), aidant ainsi à l'optimisation des candidats médicamenteux.
- Alignement sur les modèles précliniques : Applicable aux canaux ioniques, transporteurs et récepteurs, soutenant la validation des cibles dans des modèles physiologiquement pertinents.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode de la couche ultramince s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation précoce de cibles jusqu'à l'identification de composés actifs et au profilage préclinique, permettant une analyse fiable des protéines à chaque étape.
- Biologie de la découverte : Soutient la validation d'hypothèses en fournissant des données de masse précises pour l'identification et la caractérisation des protéines.
- Essais de criblage : Fournit des résultats quantitatifs reproductibles permettant une évaluation fiable des composés lors du développement de tests.
- Analytique : Génère des spectres de masse haute résolution avec une uniformité spatiale, améliorant la comparabilité des données entre différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Assure un lien entre la découverte et la phase préclinique grâce à une analyse cohérente de la masse protéique sur divers types d'échantillons.
- Réutilisation institutionnelle : Représente une capacité standardisée et robuste de préparation d'échantillons, applicable à plusieurs classes de protéines et projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive dans la détermination de la masse des protéines, réduction de l'ambiguïté mécanistique lors de la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Normalisation, reproductibilité et tolérance aux contaminants courants tels que les sels et les détergents.
- Valeur stratégique : Décisions plus pertinentes d'aller/ne pas aller grâce à une qualité améliorée des données, réduisant ainsi les risques biologiques en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation ajustée au risque fondée sur des données fiables de caractérisation des protéines.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation des échantillons en spectrométrie de masse et dans les principes de la spectrométrie de masse MALDI.
- Suppose l'accès à des réactifs de qualité HPLC, à un aspirateur sous vide et à des plaques compatibles avec la MALDI.
- Exige des procédures normalisées de nettoyage et de séchage afin d'assurer une uniformité des couches.
- Nécessite une adaptation en fonction des concentrations variables des analytes et des matrices d'échantillons.
- Est limité par la nécessité d'utiliser immédiatement les plaques après nettoyage afin d'éviter une recontamination.
Foire aux questions sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
2:05
Step 5: test of the thin layer
2:50
Step 6: sample application
3:47
Step 7: calibrant application
1:52
Step 4: preparation of the matrix solution
0:58
Step 3: making the thin layer substrate
0:20
Step 1: cleaning of the sample plate
4:20
Step 8: washing step
0:46
Step 2: preparation of the thin layer substrate solution
5:05
Step 9: acquisition of mass spectra
