Vidéo analyse bioinformatique des droits de croissance de la tige colonie de cellules embryonnaires

Ce protocole illustre une méthode de bio-informatique vidéo permettant de mesurer la croissance des colonies de cellules souches embryonnaires humaines en analysant des vidéos enregistrées en temps réel, recueillies dans un incubateur Icon Bio Station CT équipé d'une caméra pour l'imagerie vidéo. Les colonies de cellules souches embryonnaires humaines, ou hESC, sont cultivées jusqu'à une confluence de 70 %, repiquées puis incubées pendant 48 heures, après quoi les colonies hESC sont filmées pendant 48 heures supplémentaires dans le Biot ct. La vitesse de croissance est déterminée à l'aide de recettes d'analyse par segmentation, d'amélioration et de mesure développées avec le logiciel CL quant.

Les recettes sont validées par comparaison avec Adobe Photoshop, un outil d'analyse d'images qui permet un ajustement manuel précis du masque pour chaque colonie. Le domaine émergent de la bioinformatique vidéo peut être utilisé pour automatiser le traitement, l'analyse et l'extraction de données biologiques à partir de vidéos microscopiques. Bonjour, je suis Serena Lin du laboratoire du Dr Prou Talbot, du Département de biologie cellulaire et de neurosciences de l'Université de Californie à Riverside.

Bonjour, je suis Sean Fino, également du laboratoire Talbot. Bonjour, je suis TI Satish du programme de biologie cellulaire, moléculaire et du développement. Aujourd'hui, nous allons vous montrer comment mesurer la croissance des colonies de cellules souches embryonnaires humaines à l'aide d'outils de bioinformatique vidéo.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour mesurer les effets de polluants environnementaux sur le comportement des cellules souches embryonnaires humaines. Nous allons démontrer cette procédure dans notre nouvelle plateforme de cellules souches. Commençons donc.

Pour préparer les HESC en vue d'une analyse vidéo, cultiver les HESC sur des plaques de six puits revêtues de Matrigel jusqu'à une confluence de 70 %. Aspirer le milieu d'un puits contenant des HESC et rincer deux fois avec un millilitre de PBS. Ajouter un millilitre d'Accutase et incuber pendant une minute à 37 degrés Celsius sous 5 % de dioxyde de carbone. Ensuite, ajouter 10 à 12 billes de verre dans le puits et agiter doucement la plaque jusqu'au détachement complet des colonies.

Neutralisez l'Accutane à l'aide d'un millilitre de milieu de maintien de cellules souches embryonnaires humaines ou de milieu conditionné par des fibroblastes embryonnaires de souris. Récupérez les cellules détachées sans les billes dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez à 200 ×g pendant trois minutes. Jetez le surnageant et redispensez le culot avec 500 microlitres de milieu frais de maintien des cellules souches embryonnaires humaines ou de M-T-E-S-R. Répartissez 100 microlitres de la suspension de cellules souches embryonnaires humaines goutte à goutte dans plusieurs puits d'une plaque de 12 puits revêtue de Matrigel.

Agitez doucement la plaque d'avant en arrière et observez les cultures au microscope lumineux afin de vérifier que les agrégats cellulaires sont uniformément répartis dans les puits. Placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés et 5 % de dioxyde de carbone pendant 48 heures pour garantir que les cellules adhèrent bien au fond et atteignent une taille suffisante pour être facilement visualisées. Après 48 heures, aspirez le milieu et lavez les puits avec 500 microlitres de PBS afin d'éliminer les cellules non adhérentes, puis ajoutez 500 microlitres de milieu M-T-E-S-R dans chaque puit.

Placer immédiatement la plaque dans le Biot CT et commencer à acquérir des images en lapso-temporel. Essayer de sélectionner des champs présentant des colonies simples bien distinctes, peu susceptibles de croître jusqu'à fusionner avec d'autres colonies. Dans ce protocole, les cellules sont enregistrées en vidéo pendant 48 heures supplémentaires avec des images prises à des intervalles de sept minutes.

Pour créer la recette de segmentation, commencez par analyser manuellement toute la vidéo afin de vérifier qu'elle contient une colonie unique qui reste nette pendant toute la durée de l'enregistrement. Ensuite, ouvrez l'assistant de segmentation dans le logiciel CL quants et cliquez sur le bouton suivant. Sélectionnez le bon canal d'image et cliquez sur le bouton suivant.

Choisissez l'option de correspondance souple et cliquez sur Suivant. Sélectionnez une ou deux régions souhaitées en traçant un cercle allant du bord extérieur jusqu'à la zone centrale de la colonie. Cette zone doit être aussi petite que possible, tout en étant représentative de l'ensemble de la colonie.

Ne sélectionnez pas trop de régions, car cela pourrait entraîner une application inexacte du masque. Cliquez sur le bouton suivant. Sélectionnez les régions non souhaitées en entourant les zones qui ne font pas partie de la colonie ni du fond.

Ces régions présentent des motifs qui doivent être supprimés, tels que les débris et les cellules mortes. Cliquez sur suivant. Sélectionnez le fond en entourant les régions qui ne sont ni des colonies, ni des débris, ni des cellules mortes.

Le fond doit être uniforme et susceptible d'apparaître dans chaque image. En général, nous sélectionnons le fond gris autour de la colonie. Cliquez sur le bouton suivant.

Un masque coloré doit s'afficher sur la région d'intérêt si le masque ne couvre pas précisément cette région. La plage de seuil de segmentation située en bas à droite de l'écran peut être augmentée ou réduite si une modification du masque est nécessaire. Sélectionnez la mise à jour des régions correspondantes de manière souple.

Cela permet de modifier les zones souhaitées, non souhaitées ou d'arrière-plan. Si le masque est satisfaisant, sélectionnez appliquer le seuil et enregistrez mon masque. Ensuite, cliquez sur le bouton suivant.

Le masque sera ensuite affiché dans une couleur différente. Sélectionnez « terminer ». La recette doit apparaître dans le coin supérieur droit du logiciel en tant que recette de segmentation.

Renommez la recette si désiré en cliquant avec le bouton droit et en saisissant un nouveau nom. Pour appliquer la recette, cliquez avec le bouton droit et placez la souris au-dessus.

Appliquer la recette. Un menu apparaîtra permettant de sélectionner le nombre d'images à utiliser. Régler l'intervalle d'images à toutes les 20 images afin d'assurer la fidélité du masque.

Vérifiez manuellement de façon aléatoire 10 % des images auxquelles le masque a été appliqué afin de créer une recette d'amélioration éliminant les régions indésirables dues aux débris. Cliquez avec le bouton droit sur le dossier de recette d'amélioration, puis cliquez sur Nouveau. Une nouvelle recette d'amélioration doit s'afficher à partir du champ de vision d'origine.

Déplacez le curseur de la souris sur les icônes de la barre d'outils pour identifier le bouton d'activation du module d'amélioration situé à droite de l'image, puis cliquez dessus. Sélectionnez le menu déroulant d'étiquetage. Sélectionnez l'étiquetage pour la connexion deux.

Une nouvelle barre de tâches doit s'afficher. Prenez le masque initial à partir de la recette de segmentation et faites-le glisser vers la zone d'entrée. La barre doit maintenant afficher le numéro du masque d'entrée.

Faites glisser l'icône portant le numéro du masque d'entrée vers l'icône du masque zéro. Recherchez la taille minimale dans la barre des tâches et ajustez le nombre jusqu'à ce que seule la région d'intérêt soit affichée. Assurez-vous de cliquer sur exécuter pour chaque essai d'ajustement.

Une fois que l'ajustement de la taille minimale est satisfaisant, cliquez sur la recette d'amélioration précédente située en bas de l'écran, puis sélectionnez « enregistrer dans la recette ». Le logiciel demande maintenant de remplacer la recette sélectionnée : choisissez « oui » pour le point. Vérifiez la recette d'amélioration en utilisant la même procédure que celle utilisée pour le contrôle ponctuel de la segmentation.

Si vous êtes satisfait des recettes de segmentation et d'amélioration, passez à la création du modèle de mesure. Pour commencer, sélectionnez « créer un modèle de mesure » dans la barre d'outils située à droite. Dans la fenêtre de mesure, placez le curseur sur la figure de cellule en image clipart.

Maintenez la touche contrôle enfoncée et sélectionnez la cellule située dans la section morphologie, décochez le paramètre par défaut et cochez le paramètre de surface. Ensuite, quittez la fenêtre du modèle. Sélectionnez l'icône.

Créer une recette de mesure. Renommer la recette. Accéder à l'onglet modèle et le sélectionner. Dans le coin supérieur droit, faire glisser et déposer le modèle de mesure précédemment créé dans la fenêtre de mesure.

Cliquez sur « oui » pour continuer dans la fenêtre du protocole de mesure, sélectionnez les affectations de canaux. Ensuite, sélectionnez les affectations de masque pour la cellule entière. Puis choisissez l'option cellule entière. Pour le masque amélioré, sélectionnez le protocole de mesure sous l'onglet protocole.

Dans la fenêtre principale, sélectionnez l'icône d'enregistrement située dans la fenêtre de la recette de mesure. Ensuite, fermez la fenêtre. Fermez puis rouvrez le champ de vision. Cliquez avec le bouton droit sur le dossier de la liste des recettes, puis cliquez sur « Nouveau » et faites glisser les recettes dans l'ordre d'application nécessaire dans la liste des recettes, sélectionnez « Verrouiller la liste des recettes », puis exécutez les recettes séquentiellement sur les données vidéo à l'aide d'Adobe Photoshop.

Une trame sur vingt des mêmes colonies a été analysée. Ouvrez manuellement une trame d'une image de colonie dans Adobe Photoshop. Cliquez sur l'outil baguette magique dans la barre d'outils.

Cliquez sur la zone autour de la colonie afin que tout le champ soit couvert, sauf la région de la colonie. Assurez-vous que la ligne pointillée entoure bien la périphérie de la colonie et ne se trouve pas à l'intérieur. Si la ligne pointillée n'entoure pas correctement la périphérie, modifiez la valeur de tolérance dans la barre d'outils supérieure en conséquence.

Cliquez sur « Modifier » en mode de masque rapide dans la barre d'outils, puis cliquez sur la colonie afin de la sélectionner. Allez dans la fenêtre, ouvrez le menu déroulant et cliquez sur « Histogramme ». Le cache doit être réglé sur un.

Si le cache est à deux, cliquez sur le point d'exclamation de l'expression pour modifier le cache à un. Enregistrez la valeur du pixel dans un tableur. Répétez le processus ci-dessus pour chaque image numéro 20.

Les données recueillies à l’aide de Photoshop et du logiciel CL quant peuvent ensuite être tracées ensemble. Notre protocole de quantification de la croissance des colonies de cellules souches embryonnaires humaines illustre une application de la bio-informatique vidéo à un problème biologique. Nous présentons ici un graphique comparant l’augmentation de la taille des colonies sur une période de 48 heures, telle qu’elle a été déterminée à l’aide du logiciel CL quant et d’Adobe Photoshop.

Le graphique montre cinq colonies différentes, chacune analysée par les deux logiciels. Chaque colonie est représentée par une couleur différente. Les lignes continues ont été obtenues à l'aide du logiciel sail quant, tandis que les lignes en pointillés ont été collectées à l'aide de Photoshop.

Le graphique des données brutes montre que les deux méthodes de mesure sont en bon accord, compte tenu du fait que les colonies ont une taille initiale différente. Cette figure présente les données reprises sous forme de pourcentage d'augmentation de la taille des colonies. Les taux de croissance sont similaires, quelle que soit la taille initiale des colonies, et les deux méthodes d'analyse fournissent des résultats comparables.

Le graphique suivant affiche les moyennes des données précédentes de variation en pourcentage de la croissance des colonies de CESh. Ce graphique montre clairement un bon accord entre l'analyse effectuée à l'aide de l'infobiotique vidéo et d'Adobe Photoshop. Nous venons de vous montrer comment mesurer la croissance des colonies de cellules souches embryonnaires humaines en utilisant des outils d'infobiotique vidéo.

Lorsque vous effectuez cette procédure en utilisant la microscopie en contraste de phase, veillez à inclure l'auréole entourant la colonie afin d'assurer une sélection précise des colonies par le logiciel. Il est également important de garder à l'esprit que d'autres méthodes de culture, d'incubation et d'acquisition vidéo peuvent être utilisées à la place du protocole que nous avons démontré. Une fois que les protocoles seront élaborés et validés, ils permettront d'effectuer les analyses beaucoup plus rapidement et avec moins de variations expérimentales que l'analyse manuelle.

Voilà, c'est terminé. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.