Isoler des cellules souches à partir des tissus mous musculo-squelettiques

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des cellules souches adultes à partir de tissus mous musculosquelettiques tels que le muscle squelettique. Cela est réalisé en prélevant d'abord une biopsie du tissu mou, en le débridant et en le hachant finement. La deuxième étape de la procédure consiste à digérer enzymatiquement le tissu.

La troisième étape de la procédure consiste à isoler les cellules souches par des étapes répétées de pré-plaquage. La dernière étape de la procédure est l'identification des cellules souches isolées. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus afin de montrer le comportement morphologique et cellulaire des cellules à l'aide d'immunofluorescence, de microscopie et/ou de cytométrie en flux.

Bonjour, je suis y Lee du Laboratoire de pathologie moléculaire du Département de chirurgie orthopédique de l'Université de Pittsburgh. Aujourd'hui, je vais vous montrer comment isoler une cellule souche adulte à partir des tissus mous du système squelettique de Mus, tels que le muscle squelettique. Bonjour, je suis le Dr Johnny Ward.

Je suis professeur à la faculté de médecine de l'Université de Pittsburgh, au sein du département de chirurgie orthopédique. Je travaille étroitement, vous savez, avec le Dr Young Lee et ces procédures visant à isoler, vous savez, différents types de cellules souches à partir du muscle squelettique et de tissus conjonctifs tels que le tissu adipeux. Nous utilisons ces procédures dans notre laboratoire pour isoler des cellules souches destinées essentiellement à des études de recherche sur les applications en médecine translationnelle.

Étudions cela de plus près. Les tissus à partir desquels les cellules souches peuvent être isolées incluent les tendons et les muscles squelettiques prélevés sur les muscles tibiaux ou sur le muscle soléaire de la patte postérieure de souris de type sauvage. Après avoir retiré les résidus de peau et d'os, placer les tissus dans une boîte contenant du HBSS froid supplémenté avec 5 % de FBS.

Ensuite, placez séparément le tissu sur des boîtes traitées au collagène contenant du HBSS froid. Nous utiliserons des tissus musculaires squelettiques pour démontrer les procédures de base de dissociation et de digestion tissulaire. Utilisez des ciseaux microchirurgicaux et/ou des lames de scalpel pour hacher finement les tissus squelettiques en une suspension grossière en vue de la digestion enzymatique des tissus.

Commencez par transférer les homogénats de tissu MIT dans des tubes séparés de 15 millilitres et centrifugez-les à environ 3 500 tr/min à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Éliminez le lavage SANE en resuspendant dans du HBSS et répétez la centrifugation. Après avoir éliminé le surnageant, digérez les homogénats en ajoutant 10 millilitres de collagénase 0,2 % préchauffée.

Type 11 : incuber pendant 60 minutes à 37 degrés Celsius, en agitant les tubes manuellement toutes les 10 minutes. Une fois l'incubation de 60 minutes terminée, centrifuger, puis resuspendre les suspensions dans 10 millilitres de solution DYS. Incuber ensuite pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius, en agitant manuellement toutes les 10 minutes. Après l'incubation de 45 minutes, centrifuger et resuspendre les suspensions dans 10 millilitres de solution de 0,2 % de trips dans du HBSS.

Nous incubons généralement pendant 15 à 20 minutes à 37 degrés Celsius tout en inversant les tubes toutes les 10 minutes, l'incubation est alors terminée. Lorsque suffisamment de cellules isolées sont libérées à partir des tissus, comme illustré ici, centrifuger les cellules obtenues et resuspendre le culot cellulaire dans cinq millilitres de milieu de prolifération. Dissocier la suspension cellulaire en faisant passer l'extrait à travers une série d'aiguilles : deux fois à travers une aiguille de calibre 18, puis une fois à travers une aiguille de calibre 23 et enfin une fois à travers une aiguille de calibre 27.

Enfin, faire passer l'extrait cellulaire à travers un tamis cellulaire de 70 microns pour commencer la technique de prépl. Centrifuger l'extrait cellulaire qui vient d'être préparé et resuspendre les culots dans le milieu de prolifération. Plaquer cinq millilitres du mélange cellulaire dans un flacon T25 revêtu de collagène et désigner comme PP1, puis incuber à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié avec 5 % de dioxyde de carbone pendant deux heures.

Après deux heures, transférez les cellules non adhérentes dans un nouveau flacon T 25 revêtu de collagène et étiquetez-le PP deux. Ajoutez cinq millilitres de PM dans le flacon T 25 précédent étiqueté PP un.

Replacer les deux flacons dans l’incubateur pendant 24 heures. Après 24 heures, transférer les cellules non adhérentes du PP deux vers un nouveau flacon T 25 recouvert de collagène ENC et l’étiqueter comme PP trois. Ajouter cinq millilitres de milieu de prolifération dans le flacon étiqueté PP deux.

Replacer les flacons dans l'incubateur. Répéter la procédure toutes les 24 heures jusqu'à la population PP six. La population de cellules souches est créée.

Les cellules PP six isolées sont très peu nombreuses et doivent être maintenues dans un milieu de prolifération riche en FBS, qui est renouvelé quotidiennement. Toutefois, la majorité des cellules en culture PP six mourront au cours des une à deux semaines suivantes de culture.

Une population de PP6 saine et abondante est généralement obtenue après une à deux semaines supplémentaires de culture. Maintenir également tous les autres groupes de cellules en suspension, en permettant leur prolifération et en les examinant régulièrement à l’aide d’un microscope inversé. Les cellules adhérentes précoces qui se fixent aux flacons PP1 et PP2 sont principalement des cellules fibrotiques.

Les cellules qui adhèrent à des flacons revêtus de collagène après une période plus longue, comprise entre 48 et 96 heures. Les PP trois et PP quatre sont principalement des myoblastes. Alors que les cellules satellites musculaires sont souvent observées principalement dans la PP cinq, les préplasmocytes ultérieurs, à 96 heures ou plus tard (PP six), sont considérés comme des cellules souches adultes et apparaissent petites, rondes et translucides.

Au début de leur isolement, ils peuvent être davantage caractérisés par immunohistochimie en fonction de leur expression de marqueurs de cellules souches tels que la cellule souche, l'antigène un et CDC 34. Nous venons de vous montrer comment isoler des cellules souches à partir d'une seconde masse du souris. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir les stéroïdes pendant toutes les étapes du protocole.

Une fois la cellule souche isolée, veillez à cultiver ces cellules à faible densité afin de préserver les caractéristiques des cellules souches. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé, bonne chance dans votre expérience, et je vous souhaite bon courage pour l'utiliser dans vos expériences.

Merci.