Une approche de génétique inverse pour tester redondance fonctionnelle pendant l'embryogenèse

L'objectif général de cette procédure est de déterminer si deux gènes sont fonctionnellement redondants pour la spécification d'une lignée cellulaire définie. Cela est réalisé en premier lieu en définissant le phénotype d'absence de fonction de chaque gène individuel à l'aide de morpholinos spécifiques au gène injectés dans des embryons de poisson zèbre en développement. La deuxième étape de la procédure consiste à mettre au point un test permettant de quantifier la spécification ou la différenciation de la lignée cellulaire.

Par exemple, en utilisant une souche de poisson rapporteur, comme nous le montrerons ici. La troisième étape de la procédure consiste à combiner deux morpholinos FENO pour cibler la perte de fonction des deux gènes simultanément. La dernière étape de la procédure est d'évaluer le phénotype provoqué par l'extinction double.

En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent une perte ou un gain de fonction pour les cellules d'une lignée spécifique par l'examen du rapporteur de lignée ou l'analyse de l'expression d'un marqueur spécifique à la lignée. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la combinaison de knockouts dans le modèle murin, est que deux voire trois gènes peuvent être ciblés dans le modèle de poisson simplement en combinant des morpholinos validés dans une seule expérience. Plus de 100 embryons peuvent être injectés et les phénotypes évalués en quelques jours.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles. En biologie du développement, par exemple pour définir les voies transcriptionnelles qui contrôlent le destin cellulaire, les voies régulatrices clés sont souvent représentées par de petites familles de gènes apparentés qui sont fonctionnellement redondants. Leur rôle n'est donc pas évident lors d'études d'invalidation chez la souris en raison d'une compensation par les gènes frères.

Bien que ce modèle puisse fournir des informations sur l'embryogenèse du poisson zèbre, les résultats peuvent être appliqués à d'autres systèmes tels que la souris, puisque les mêmes programmes génétiques sont généralement bien conservés au cours de l'évolution. Préparez les plaques de microinjection avant d'injecter les embryons. Versez environ 12 millilitres d'agarose à 2 % dans de l'eau du système, c'est-à-dire de l'eau propre prélevée directement sur le système de l'aquarium, dans le couvercle retourné d'une boîte de Pétri de 100 millimètres.

Placer deux lames de microscope à environ 45 degrés dans les deux côtés du couvercle. Une fois que l'agarose est solidifiée, retirer délicatement les lames du couvercle, créant ainsi des sillons où les embryons seront positionnés pendant l'injection. Les stocks de morpholinos sont conservés à température ambiante à une concentration de un millimolaire dans de l'eau distillée déionisée stérile avant l'injection. Incuber les stocks de morpholinos à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes afin de s'assurer qu'ils sont complètement en solution.

Laisser refroidir les solutions mères à température ambiante. Chaque morpholino nouvellement conçu doit être validé empiriquement quant à son activité et à la tolérance de l'embryon. Dans des tubes de microcentrifugeuse, préparer une dilution sérielle à partir d'une ou deux dilutions de la solution mère dans de l'eau distillée désionisée, afin d'obtenir des concentrations de travail de un millimolaire, 0,5 millimolaire, 0,25 millimolaire et 0,125 millimolaire.

Sous un microscope stéréo, utilisez une aspiration pour charger par l’avant une aiguille d’injection calibrée, fixée au micromanipulateur et correctement positionnée. Remplissez l’aiguille avec environ un microlitre de la solution de morpholino à la concentration la plus faible. Utilisez une pipette de transfert pour déplacer les embryons fécondés à une cellule dans les sillons de la plaque d’microinjection.

Utilisez la pipette pour éliminer l'excès d'eau de la plaque afin que les embryons tombent au fond de la rigole. Placez la plaque d'injection sous le microscope, abaissez l'aiguille à travers la chorion et dans le vitellus. Injectez chaque embryon avant de retirer l'aiguille et de repositionner la plaque d'injection pour accéder à l'embryon suivant.

Lors de l'apprentissage de l'injection, il peut être utile d'utiliser un colorant vital pour visualiser l'injection dans la cellule, comme illustré ici, puis transférer les embryons dans une boîte de Pétri de 100 millimètres contenant de l'eau de milieu, et les cultiver à 28,5 degrés Celsius. Éjecter toute solution de morpholino restante de l'aiguille, puis la remplir avec la concentration de morpholino immédiatement supérieure pour injecter le prochain lot d'embryons à un stade de développement approprié. Examiner les embryons pour détecter les phénotypes à chaque concentration de morpholino injectée.

La dose seuil pour chaque morphotype est la dose la plus faible à laquelle on observe un phénotype défini et fiable. Plusieurs cycles de titrage peuvent être nécessaires pour déterminer précisément le seuil. Pour rechercher une interaction génétique entre deux gènes distincts.

Préparez un mélange des deux morphos d'intérêt, chacun à sa concentration seuil respective. Il est important de garder à l'esprit que les embryons peuvent ne pas tolérer plus de 20 nanogrammes de morpho au total par injection. Injectez les embryons de la même manière qu'auparavant.

Conservez des volumes d'injection constants entre les groupes expérimentaux et les groupes témoins, qui doivent inclure des lots injectés avec chaque morpholino seul sous le microscope stéréoscopique. Surveillez immédiatement après l'injection et à plusieurs reprises au cours de la journée les embryons injectés ; utilisez une pipette de transfert pour éliminer tout embryon mort ou en voie de mort. Étant donné que ceux-ci peuvent compromettre la viabilité des embryons restants, retirez à tout moment à l’aide d’une pipette de transfert les embryons sédentaires ou euthanasiés.

Indiquer une lame creuse pour l'observation. Pour la photographie. Utiliser des pinces fines pour retirer la chorion si nécessaire.

Stabiliser l'embryon dans une goutte de méthylcellulose à 3 % ; examiner les embryons à la recherche d'un phénotype distinctif, propre à la combinaison de morpholinos, par opposition à une pénétrance accrue du phénotype observé avec un seul morpholino. Voici plusieurs embryons de type sauvage injectés avec des morpholinos à la dose seuil. Pour gata5, le phénotype typique est la cardia bifida, ou deux cœurs, car les progéniteurs n'ont pas fusionné au niveau de la ligne médiane.

Remarquez les cardiomyocytes positifs pour la GFP, indiqués par les flèches. Le phénotype de six morpholinos comprend des cœurs mal formés qui ne se bouclent pas correctement. Ces embryons développent également des cardiomyocytes positifs pour la GFP.

Cependant, les embryons injectés avec une combinaison des deux morpholinos ciblant gata five et gata six présentés ici montrent une perte totale du développement des cardiomyocytes, indiquant que l'expression de gata five ou de gata six est nécessaire pour que les cardiomyocytes se développent. Ces deux gènes sont fonctionnellement redondants pour la spécification des cardiomyocytes.

Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de valider complètement vos morphos et d'être aussi certain que possible qu'ils représentent une réduction réelle de l'expression d'une cible génique unique suite à cette procédure. D'autres méthodes, comme la combinaison d'allèles nuls conditionnels chez la souris, peuvent être réalisées afin de démontrer que les mêmes gènes ont une fonction similaire chez les mammifères.

Après avoir visionné la vidéo, vous devriez bien comprendre comment déterminer si deux gènes sont fonctionnellement redondants au cours de l'embryogenèse.