Visualisation et quantification des interactions intracellulaires des Neisseria meningitidis Et l'homme α-actinine par imagerie confocale

L'objectif général de l'expérience suivante est d'évaluer le degré de colocalisation des bactéries internalisées, RIA Meningitidis, avec la protéine cytosquelettique Alpha Actinine. Cela est réalisé en infectant des cellules microvasculaires cérébrales humaines cultivées avec une culture bactérienne de nuit pendant trois à huit heures, afin de permettre aux bactéries d'entrer dans les cellules cibles. Dans une deuxième étape, les cellules contenant des bactéries intracellulaires sont lavées, fixées, puis perméabilisées, ce qui prépare la culture infectée à la coloration immunohistochimique des bactéries internalisées et de l'alpha actinine intracellulaire.

Après l'imagerie confocale et l'application d'un logiciel de colocalisation, les images de la colocalisation intracellulaire peuvent être observées et des résultats quantitatifs sont obtenus, montrant que Meninga Croci exprimant les OPC ainsi que la protéine membranaire peuvent interagir spécifiquement avec l'alpha-actinine intracellulaire, selon la visualisation en microscopie confocale et une analyse quantitative de colocalisation. Bonjour, je suis Isel Maria du laboratoire du professeur Mata TI au Département de médecine cellulaire et moléculaire de l'Université de Bri. Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant d'estimer le niveau de col, le rapport de bactéries intracellulaires avec les protéines du cytosquelette.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier une interaction entre la méningite mycélienne exprimant une protéine membranaire autochtone OPC et la protéine du cytosquelette alpha-actine. Commençons donc. Ce travail doit être effectué dans un laboratoire de sécurité adéquat.

Deux jours avant la procédure de coloration immuno, ensemencer la souche bactérienne d'intérêt sur gélose au bouillon cerveau-cœur. Incuber les géloses supplémentées avec 10 % de sang de cheval chauffé à 37 degrés Celsius pendant la nuit dans une atmosphère contenant 5 % de dioxyde de carbone, la veille de la coloration immuno. Utiliser une boucle de culture de 10 microlitres pour préparer une suspension de la culture bactérienne de nuit.

Dans deux millilitres de PBSB, laissez la suspension reposer pendant cinq minutes à température ambiante afin de permettre la décantation des grands agrégats bactériens. Ensuite, transférez le millilitre supérieur de la suspension dans un tube stérile sans perturber le culot, puis solubilisez les bactéries en ajoutant un millilitre de SDS à 1 % et d'hydroxyde de sodium 0,1 molaire à deux vials contenant chacun 20 microlitres de suspension bactérienne, et retournez le tube pour homogénéiser. Pour estimer le nombre de bactéries.

Mesurez la teneur en acide nucléique en déterminant l'absorbance de la solution. À 216 anters, ajustez la suspension bactérienne à la densité requise dans le milieu d'infection pour infecter les cellules endothéliales microvasculaires cérébrales humaines. Les cellules endothéliales microvasculaires cérébrales humaines ou H-B-M-E-C-A, semées deux jours avant la coloration immunologique, ont été placées sur des lamelles en verre de 16 millimètres dans les puits d'une plaque de 12 puits, et les cellules HBME ont été semées à une confluence de 50 % sur les lamelles, puis incubées toute la nuit à 37 degrés Celsius dans une atmosphère à 5 % de dioxyde de carbone ; le jour suivant.

Infecter les cellules avec la suspension bactérienne fraîchement préparée dans notre laboratoire. Un ratio d'infection de 200 à 300 unités formant colonies par cellule cible est couramment utilisé. Incuber de trois à huit heures à 37 °C en présence de 5 % de dioxyde de carbone à la fin de la période d'infection.

Lavez les cellules trois fois avec du PBS et fixez-les avec 500 microlitres de paraformaldéhyde à 2 % pendant 30 à 45 minutes à température ambiante. Après avoir éliminé le paraformaldéhyde, percez les cellules fixées au paraformaldéhyde en les incubant dans du Triton X-100 à 0,1 % dilué dans du PBS pendant 10 minutes. Lavez enfin les échantillons trois fois avec du PBS et procédez au marquage immunohistochimique comme indiqué. La coloration des bactéries intracellulaires et de l’α-actinine peut ensuite être réalisée simultanément.

Dans des plaques de 12 puits, bloquer les lamelles contenant les cellules perméabilisées avec 500 microlitres de PBS-T contenant 3 % de BSA pendant 30 à 60 minutes. Après lavage avec du PBS, transférer chaque lamelle à température ambiante dans un nouveau puit sec de la plaque de 12 puits, en ajoutant simultanément les anticorps primaires dirigés contre les bactéries et l'alpha-actinine ; 80 à 100 microlitres d'anticorps par lamelle suffisent si l'on ajoute soigneusement pour recouvrir toute la surface de la lamelle. Incuber pendant une heure à température ambiante. À la fin de l'incubation, ajouter 200 microlitres de PBS au puit, soulever la lamelle et la placer dans un nouveau puit contenant 500 microlitres de PBS. Après cinq minutes, éliminer le PBS par pipetage, puis ajouter du PBS frais. Répéter deux fois et transférer les lamelles dans un nouveau puit sec.

Ensuite, ajoutez les anticorps secondaires appropriés conjugués à différents fluorochromes, dilués dans du 1 % B-S-A-P-B-S-T. Incubez une heure à température ambiante à l'abri de la lumière. À la fin de l'incubation, effectuez un lavage comme indiqué précédemment, puis contrecolorez l'ADN avec du DPI pendant cinq minutes à température ambiante à l'abri de la lumière. À la fin de cette incubation, rincez les lamelles dans du PBS une fois, puis montez-les avec une goutte de milieu de montage. Les lamelles montées doivent être conservées à l'abri de la lumière jusqu'à ce qu'elles soient prêtes à être observées. Au microscope, nous observons et capturons des images de nos échantillons immunomarqués à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser couplé à un microscope à fluorescence episcopique inversé.

Pour commencer la procédure de microscopie confocale à balayage laser, déposez une goutte d'immersion sur l'objectif et placez la lame de spécimen, faites-la glisser sur la platine du microscope, réglez le microscope en mode visuel et localisez la zone d'intérêt à l’aide des oculaires du microscope. Nous sommes désormais prêts à utiliser le logiciel Leica. Sélectionnez le mode d'acquisition XY zed. Choisissez le format cinq 12 par cinq 12 pour les études de colocalisation.

Plus la résolution est élevée, plus l'image est précise. Ensuite, sélectionnez le mode X bidirectionnel, ce qui augmentera la vitesse de balayage et aidera à réduire le photoblanchiment. Configurez les paramètres de balayage séquentiel.

Cliquez sur la fonction SEC, puis sélectionnez entre les lignes. Choisissez les faisceaux laser en fonction des fluorochromes conjugués aux anticorps secondaires : 405 nanomètres pour DAPI, 488 nanomètres pour Alexa Fluor 488 et 561 nanomètres.

Pour trixy, activez respectivement les tubes photomultiplicateurs un, deux et trois. Réglez le haut et le bas de la pile ou de la série en Z. Ensuite, réglez la taille du pas de Z à 0,2 micromètre.

RIA Mencius est un diplocoque et, puisque chaque coccie a un diamètre approximatif de 0,5 micromètre, une taille de pas Z de 0,2 micromètre augmente la probabilité de balayer chaque coccie au moins deux fois. Définissez les paramètres finaux de balayage en sélectionnant une moyenne sur trois lignes afin d'améliorer le rapport signal sur bruit, puis cliquez sur démarrer. Des images doublement ou triplement marquées sont obtenues par balayage séquentiel à différentes longueurs d'onde et en utilisant le mode entre les lignes pour chaque canal afin d'éliminer les interférences entre les différents chromophores.

Pour évaluer la colocalisation de deux fluorochromes, sélectionnez la fonction de superposition afin de fusionner les canaux sélectionnés en une seule image. Par exemple, lorsque les deux fluorochromes Alexa 488 et trissy se colocalisent, une couleur jaune apparaîtra sur l'image superposée. Pour une reconstruction 2D nécessaire à la visualisation d'une éventuelle colocalisation, compilez la pile Z ou la série à l'aide de la fonction de projection maximale. Après avoir acquis la pile Z ou la série, traitez vos données afin d'obtenir une image orthogonale permettant de visualiser la localisation intracellulaire de divers éléments.

La quantification de la colocalisation est effectuée à l'aide du logiciel Vol City fourni par IMP. Pour commencer, créez une bibliothèque contenant des images de microscopie à balayage laser (CLSM), puis sélectionnez la fonction de mise au point étendue dans l'image située dans la barre supérieure. Cet outil combinera les coupes Z en une image 2D à analyser.

Sélectionnez maintenant l'outil de COLICALISATION. Les deux canaux à analyser doivent avoir la même profondeur de couleur. Sélectionnez la zone qui sera quantifiée.

Réglez le seuil pour supprimer tout fond. Créez un résultat de colocalisation en sélectionnant « générer la colocalisation ». Des statistiques de colocalisation seront générées pour les régions d'intérêt sélectionnées précédemment.

Ensuite, sélectionnez les coefficients de Mander R et ny. Enfin, exportez les valeurs statistiques vers un document Excel pour la présentation des données ; ci-dessous, des résultats représentatifs d'imagerie confocale de cellules endothéliales cérébrales humaines infectées par *meninga cockeye* pendant huit heures. L'emplacement des bactéries est indiqué en rouge.

Bien que la localisation de l'alpha-actinine soit indiquée en vert, des flèches vertes montrent des régions où un fort degré d'accumulation d'alpha-actinine semble s'être produit autour des bactéries. Sur cette image de superposition, plusieurs régions présentent une couleur jaune orangé, suggérant une colocalisation entre *meninga occi* et l'alpha-actinine. Sur cette image suivante, une dissection optique d'une monocouche de H-B-M-E-C infectée indique une colocalisation autour de bactéries intracellulaires situées à la base d'une cellule.

Lorsque des images tridimensionnelles de monocouches H-B-M-E-C infectées ont été traitées, une vue oblique de la surface apicale montre une bactérie Durant colorée en rouge, indiquée par la flèche rouge, où plusieurs bactéries sont localisées vers les surfaces basales des cellules endothéliales, indiquées par la flèche jaune. Un emplacement basal nettement orangé, de couleur jaune, peut être vu plus clairement dans cette coupe transversale XZ d'endon. Contrairement à afar, les expériences d'actinine au cours desquelles un marquage des bactéries internalisées et de menton ou d'actine a été effectué révèlent une colocalisation occasionnelle avec l'actine, mais une colocalisation rare avec fermenting dans les cellules H-B-M-E-C.

Comme observé dans les expériences précédentes, la rétine était concentrée autour de plusieurs bactéries internalisées indiquées par les flèches blanches. Les données ont également été analysées afin d'obtenir un chevauchement relatif. Le coefficient R, qui selon Manda représente le véritable degré de colocalisation IE, c'est-à-dire le nombre de pixels colocalisés par rapport au nombre total de pixels, ainsi que les valeurs NY pour l'alpha-actinine, la méningocine et l'actine dans l'ensemble des H-B-M-E-C infectées par des OPC exprimant des méningocoques, a révélé un chevauchement supérieur à 25 % entre la rétine et les méningocoques.

Le coefficient et Y constituent une mesure de la fréquence d'une devise du signal de rein plus abondant à chaque occurrence du signal de méningocoque cacao moins abondant. Cette mesure révèle un niveau remarquable de présence d'alpha-actinine aux alentours des méningocoques internalisés. Nous allons simplement vous montrer comment visualiser et quantifier l'introduction de bactéries internalisées avec les éléments du cytosquelette dans le cadre de cette expérience.

Il est important de se rappeler de suivre strictement les protocoles de fixation et d'immunomarquage afin de préserver l'intégrité des structures et d'éviter un fond élevé. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.