L'évaluation de la fonction cardiaque et Energétique dans les coeurs isolés de souris à l'aide

L'objectif général de l'expérience suivante est d'observer la fonction cardiaque et les aspects énergétiques chez un cœur de souris isolé et perfusé. Cela est réalisé en perfusant un cœur de souris en mode LOR. À l'aide d'une solution tampon de Krebs enrichie en glucose et en pyruvate comme deuxième étape, un ballonnet rempli d'eau est inséré dans le ventricule gauche ou VG, ce qui permet une surveillance constante de la fonction cardiaque durant l'expérience.

Ensuite, le cœur est placé dans un tube RMN de 10 millimètres et inséré dans l'aimant afin d'évaluer l'énergétique cardiaque en observant les résonances des phosphocréatines, de l'ATP et du phosphate inorganique. Les résultats obtenus montrent la fonction cardiaque et l'énergétique basées sur les ondes de pression du VG ainsi que sur la spectroscopie RMN du 31P et une spectrométrie de masse p. Bonjour, je suis Steve Kitz du Centre de Métabolisme MIT Cadre, Département d'Anesthésiologie à l'Université de Washington. Aujourd'hui, je vais vous montrer une procédure de perfusion cardiaque isolée combinée à une spectroscopie RMN du 31P.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour évaluer la fonction cardiaque et l'énergétique chez nos modèles de souris bio-ingénierisés. Commençons donc. Pour commencer ce protocole, préparez un litre de tampon KRES, également appelé tampon KH léger.

Introduire des bulles de 5 % de dioxyde de carbone et de 95 % d'oxygène dans le mélange pendant 10 à 15 minutes. Puis ajouter du chlorure de calcium à deux millimolaire, suivi des substrats, soit 10 millimolaires de glucose et 0,5 millimolaire de pyruvate. Pour ces expériences, deux systèmes distincts sont utilisés simultanément par acquisition de spectres P 31.

Un aimant BRUER 14 T est associé à une console avancée à trois composants et à un ordinateur équipé du logiciel Top Spin V 2.1 pour l'évaluation de la fonction cardiaque. Un système de perfusion cardiaque sur mesure est relié au Power Lab. Quatre systèmes d'acquisition de données 30.

Équipé du logiciel Lab Chart PRO six pour l'analyse des données. L'appareil de perfusion cardiaque comprend une pompe péristaltique Mini Pulse Three, contrôlée par un régulateur de pompe STH, utilisée pour perfuser le tampon KH. La régulation de la température cardiaque durant l'expérience de RMN est essentielle. Des circulateurs chauffants permettent de maintenir la température entre 37,0 et 37,5 degrés Celsius tandis que le cœur est placé dans l'aimant, et la température est surveillée tout au long de l'expérience à l'aide d'une sonde de température à fibre optique.

Pendant toute la durée de l'expérience, la pression du VG et la pression de perfusion sont surveillées à l'aide de transducteurs de pression reliés à un système d'acquisition de données et affichées à l'aide du logiciel fourni. Un transducteur physiologique est utilisé pour surveiller la pression du VG et un transducteur de pression artérielle jetable est utilisé pour surveiller la pression de perfusion. Enfin, un cordon ombilical est utilisé pour acheminer le tampon chauffé et oxygéné vers le cœur.

Une fois à l'intérieur de l'aimant, avant le début de l'expérience, étalonner les capteurs de pression à l'aide du manomètre étalon figurant sur la première image, sans appliquer de pression sur le capteur, afin de régler le zéro de l'étalonnage. Ensuite, gonfler ce manomètre figurant sur l'image à une pression plus élevée. Saisir cette valeur dans le programme informatique.

Ensuite, vérifiez que les transducteurs de pression ont été correctement étalonnés en gonflant ce manomètre à figuration momentanée à des pressions connues et en les vérifiant sur l'écran de l'ordinateur. Une fois les transducteurs de pression étalonnés, étalonnez la sonde RMN à l'aide d'un tube RMN de 10 millimètres contenant un échantillon standard de phosphate de sodium à 150 millimolaire. Effectuez l'étalonnage à l'aide du logiciel Top Spin.

Tout d'abord, régler l'échantillon afin d'ajuster la fréquence du signal du phosphore. Ensuite, effectuer le shiming de l'échantillon pour créer un champ magnétique homogène. Cette calibration initiale facilite la détection du signal et réduit le temps nécessaire pour commencer la période d'acquisition.

Une fois le cœur positionné dans la sonde pour commencer l'extraction du cœur de souris, injecter 200 unités d'héparine par voie intrapéritonéale afin de réduire la coagulation. Après cinq minutes, administrer 175 milligrammes par kilogramme de pentobarbital de sodium par voie intrapéritonéale. Une fois la souris anesthésiée, la placer sur le dos et fixer les pattes avant et arrière avec du ruban adhésif afin d'exposer la région thoracique.

Effectuez une pincée au niveau de l'orteil pour vous assurer que la souris est complètement anesthésiée. Ouvrez la cavité péritonéale et la poitrine avec des ciseaux, puis utilisez une pince pour écarter la cage thoracique et exposer la cavité thoracique. Saisissez le tissu pulmonaire et soulevez délicatement le cœur à l’aide de ciseaux courbes.

Couper les gros vaisseaux situés derrière le cœur et continuer lentement vers la tête de la souris jusqu'à ce que le cœur soit libéré. Arrêter immédiatement le cœur dans du tampon KH glacé. Maintenir les organes sur de la glace et retirer rapidement les poumons.

Identifier les lobes du thymus et les écarter délicatement pour exposer l'aorte. Ensuite, retirer le thymus. Enfin, isoler l'aorte en éliminant soigneusement tous les tissus environnants.

À l'aide de forceps de suture microchirurgicaux, maintenez généralement les deux parois de l'aorte afin d'exposer la lumière. Ensuite, placez délicatement l'aorte sur la canule. Fabriquée à partir de tubulure en polyéthylène d'un diamètre extérieur de 0,965 millimètre.

Fixez l'aorte en place à l'aide d'une pince pour micro-vaisseaux et liez rapidement des fils de suture autour de l'aorte. Une fois les points de suture noués, retirez la pince. Utilisez la pince à forceps pour vérifier soigneusement que la canule se trouve au-dessus de la racine aortique.

Ajoutez tous les liens supplémentaires nécessaires pour maintenir le cœur en place. Retirez tout tissu excédentaire à l’aide de la pince et des ciseaux microchirurgicaux. Ensuite, pratiquez une petite incision dans l’oreillette gauche.

Tenez délicatement le cœur et insérez soigneusement un tube en polyéthylène de 0,61 mm de diamètre externe à travers l'oreillette gauche, la cavité du ventricule gauche, puis faites-le sortir par l'apex. Coupez l'excès de tube. Ensuite, insérez un ballonnet dégonflé rempli d'eau à travers l'oreillette dans le ventricule gauche.

Fixez le ballonnet en place à l’aide de ruban adhésif. Augmentez ensuite progressivement la vitesse de la pompe péristaltique afin d’assurer un débit suffisant vers le cœur. Continuez à perfuser le cœur avec le tampon KH à un débit constant équivalent à environ deux millilitres par minute jusqu’à ce que le cœur soit placé dans la sonde RMN.

Remplir le ballonnet du VG avec un petit volume à l’aide d’une seringue micrométrique afin de vérifier le bon fonctionnement du transducteur de pression du VG pour la spectroscopie RMN. Insérer d’abord soigneusement le cœur dans un tube RMN de 10 millimètres. Un rotor à large orifice est placé autour du tube RMN pour faciliter le positionnement correct du tube.

Dans la sonde, fixez fermement l'appareil entier au cordon ombilical à l'aide de ruban adhésif. Ensuite, abaissez lentement le cordon ombilical dans l'alésage supérieur de l'aimant jusqu'à ce que le tube RMN contenant le cœur se trouve à l'intérieur de la bobine de la sonde RMN de 10 millimètres. Une fois que le cœur est correctement positionné dans la sonde, ajustez le débit de la pompe parasite afin d'obtenir une pression de perfusion de 80 millimètres de mercure.

Conserver la pression de perfusion en activant le mécanisme de maintien sur le contrôleur de la pompe. Laisser un temps d'équilibre de 15 à 20 minutes pour le cœur. Pendant la période d'équilibre, ajuster le volume du ballonnet du VG pour obtenir une pression diastolique finale comprise entre huit et dix millimètres de mercure.

Ensuite, optimisez les paramètres du spectromètre afin d'obtenir le meilleur signal phosphore possible. Réglez l'appareil RMN en ajustant l'impulsion radio pour que la fréquence corresponde à la résonance du noyau de phosphore. Puis, effectuez le shimage de l'échantillon afin d'homogénéiser le champ magnétique après la période d'équilibration.

Commencez l'acquisition de plusieurs spectres de RMN du phosphore 31. La durée d'acquisition de chaque spectre dépend de la puissance du champ magnétique, de la taille de l'échantillon et du rapport signal sur bruit requis pour une expérience spécifique. Ici, les spectres sont obtenus à l'aide d'un aimant de 14 Tesla en moyennant le signal issu de 256 impulsions radiofréquence de 20 microsecondes avec un angle de bascule de 60 degrés et des délais de 2,0 seconde.

Cette expérience nécessitera environ 10 minutes. Une mesure typique de la fonction cardiaque, la pression développée du VG, s'obtient en soustrayant la pression télédiastolique ou EDP de la pression systolique. Chez une souris C57BL/6 normale, la pression développée du ventricule gauche est généralement comprise entre 100 et 110 millimètres de mercure pour une pression télédiastolique fixe de huit à 10 millimètres de mercure.

Des courbes de compliance représentatives sont présentées pour des souris témoins et des souris soumises à un bandage aortique. La fonction systolique est représentée par la pression développée du VG en fonction de l'augmentation des volumes du VG, déterminée par le volume du ballonnet intraventriculaire. La fonction diastolique est représentée par la pression diastolique du VG en fonction de l'augmentation des volumes du VG.

Le spectre de RMN du 31P d'un cœur de souris isolé et perfusé fournit des signaux provenant de la phosphocréatine (PCR), des trois phosphates de l'ATP et du phosphate inorganique (Pi). Ici, le pic de Pi est relativement faible. Ceci est typique d'un cœur perfusé en conditions aérobies et alimenté par du pyruvate ou des acides gras.

En plus du glucose pendant les périodes d'ischémie, ce pic augmente tandis que le pic de PCR diminue. Je viens de vous montrer comment préparer un cœur de souris pour la perfusion afin que la fonction cardiaque et les paramètres énergétiques puissent être mesurés simultanément au cours de l'expérience. Il est important de s'assurer que le cœur est correctement perfusé.

Sinon, vos données de RMN ne seront pas fiables. Voilà, c'est tout. Merci et bonne chance avec vos expériences.