Ciblage des structures cérébrales profondes avec des microinjections de livraison des médicaments, des vecteurs viraux, ou de cellules
1 décembre 2010
Dans cet article, nous montrons une méthode pour faire des aiguilles capillaires en verre avec une lumière de 50 um. Cette technique réduit considérablement les dommages au cerveau, minimise la diffusion passive des médicaments et permet un ciblage précis dans le cerveau des rongeurs.
L'objectif général de cette procédure est d'effectuer des micro-injections très précises dans des structures cérébrales profondes afin d'administrer des médicaments, des vecteurs viraux ou des greffes cellulaires. Cette opération s'effectue en fabriquant tout d'abord des aiguilles en capillaires de verre présentant un lumen de 50 micromètres. La deuxième étape de la procédure consiste à remplir à 50 % l'aiguille d'huile minérale par capillarité et à insérer le piston par l'extrémité la plus large du tube.
La troisième étape de la procédure consiste à charger l'aiguille avec la substance ou la suspension cellulaire que vous souhaitez injecter. La dernière étape de la procédure consiste à introduire la pointe de l'aiguille et à injecter la substance à un débit très faible dans une structure cérébrale profonde. En définitive, des résultats peuvent être obtenus qui montrent un ciblage très précis de substances dans le cerveau par des micro-injections à l'aide d'un tube capillaire en verre.
Bonjour, je suis Oscar Gonzalez du Laboratoire de neurosciences de l'École de psychologie à l'Université de Colima, au Mexique. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure de microinjection à l'aide d'une pipette capillaire en verre pour administrer des médicaments dans le cerveau de la souris. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les cellules souches neuronales adultes.
Commençons donc. L'utilisation d'aiguilles capillaires en verre avec un lumen de 50 micromètres pour les micro-injections dans le cerveau réduit considérablement les lésions cérébrales, minimise la diffusion passive des médicaments et permet un ciblage précis du cerveau du rongeur. Avant de pouvoir effectuer des micro-injections, il est nécessaire de fabriquer les aiguilles en verre.
Commencez par insérer le tube en verre capillaire dans une électrode à haute résistance d'un tireur de micropipettes. Ensuite, allumez l'électrode du tireur de micropipettes. Pour chauffer le milieu du tube en verre afin d'assouplir localement le verre, étirez le tube le long de son axe longitudinal sur une distance initiale de trois à cinq millimètres, suffisante pour provoquer une réduction du diamètre du tube en verre dans la zone localisée.
Continuez à étirer le tube en verre jusqu'à ce qu'il casse. Répétez ces étapes pour créer deux aiguilles identiques à un seul brin. Placez maintenant les aiguilles en verre dans un micro-foyer.
Un angle de 30 degrés suffit pour biseauter la pointe. Enfin, placez les aiguilles sous le microscope et vérifiez qu'elles possèdent toutes deux le bon diamètre intérieur. Pour la plupart des médicaments hydrophiles, un diamètre intérieur de 30 à 50 micromètres est idéal avec les aiguilles construites.
Voyons comment les utiliser pour des micro-injections. Commencez par remplir l'aiguille préparée avec de l'huile minérale par l'extrémité la plus large. Laissez l'huile minérale pénétrer par capillarité jusqu'à ce qu'elle atteigne environ 50 % de la longueur du tube capillaire.
Mettre de la graisse à vide sur l'extrémité la plus large de l'aiguille et insérer le piston à travers celle-ci. Pousser doucement l'huile minérale jusqu'à ce qu'une petite goutte apparaisse à l'extrémité de l'aiguille en verre. Fixer ensuite l'aiguille dans le porte-aiguille du micro-injecteur et commencer à préparer l'animal pour l'injection.
Tout d'abord, placez un tapis chauffant sur le support animal stéréotaxique afin de maintenir la température corporelle de l'animal à 37 degrés Celsius. Rasez la tête de la souris anesthésiée, puis placez-la et fixez-la dans l'appareil stéréotaxique. À l'aide de barres auriculaires et d'un support dentaire, utilisez une lame chirurgicale pour inciser la peau depuis les oreilles jusqu'à la ligne crânienne du Lambda.
Polissez le crâne avec un coton-tige pour le sécher et retirez la peau du champ opératoire. Ensuite, utilisez la pointe de l'aiguille en verre pour repérer le sommet de la suture bgma et définir à cet endroit la position initiale de l'injection. Réglez maintenant le point sur le crâne qui doit être percé en déplaçant les axes X et Y du dispositif stéréotaxique au-dessus du crâne.
À l'aide d'un micro-perceuse de recherche, percer soigneusement des trous aux coordonnées sélectionnées à l'aide de pinces fines. Retirer délicatement la couche osseuse la plus profonde et rompre la membrane dure-mère. Vous observerez un écoulement de liquide céphalorachidien.
Pour confirmer que l'aiguille peut traverser les trous percés, abaissez lentement l'aiguille en verre à l'aide de l'axe Z du dispositif stéréotaxique. Pipetez à présent un microlitre du médicament à injecter et déposez-le sur un petit morceau de parfum. Placez le parfum sur le crâne.
Aspirez le médicament en tournant la molette du micro-injecteur tout en vérifiant au microscope que le liquide remonte dans l'aiguille en verre. Retirez le film parafin et réinitialisez les coordonnées à zéro. Déplacez ensuite l'aiguille jusqu'aux coordonnées sélectionnées et abaissez le support jusqu'à ce que l'extrémité de l'aiguille en verre touche doucement la surface du cerveau, puis réglez la coordonnée Z à zéro.
Introduire l'aiguille en verre dans le parenchyme cérébral à la profondeur souhaitée. Injecter lentement le médicament à un débit d'environ un nanolitre par seconde. Une fois le volume souhaité injecté, laisser le médicament diffuser dans le parenchyme pendant deux minutes, puis retirer l'aiguille de manière régulière et lente.
Enfin, collez la plaie chirurgicale et retirez l'animal de l'appareil stéréotaxique. Placez l'animal dans une cage préchauffée pour la récupération de l'anesthésie. Nous allons maintenant montrer quelques résultats de microinjection.
De la lysophosphatidylcholine ou lyin a été injectée dans le corps calleux, ce qui provoque une démyélinisation des voies de substance blanche, afin de minimiser les lésions cérébrales induites par l'aiguille en verre. Seulement 20 µL de lyin ont été injectés. La démyélinisation est indiquée par l'absence d'expression de la protéine basique de la myéline dans les voies de substance blanche ; une injection très précise est ainsi obtenue, et un trajet d'aiguille très étroit minimise les lésions cérébrales.
Nous venons de vous montrer comment fabriquer des aiguilles en verre pour effectuer des micro-injections dans des structures cérébrales profondes. Lorsque vous réalisez cette procédure, il est important de garder à l'esprit de disposer de tout l'équipement et de tous les matériaux prêts à être utilisés en salle d'opération. Voilà, c'est terminé.
Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.
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Aperçu
Cet article présente une méthode permettant de fabriquer des aiguilles en capillaires de verre avec une lumière de 50 µm, permettant des micro-injections précises dans les structures cérébrales profondes. Cette technique minimise les lésions cérébrales et réduit la diffusion passive des médicaments, permettant une administration ciblée chez les modèles rongeurs.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Techniques de microinjection
- Systèmes de délivrance de médicaments
Contexte
- Les micro-injections sont essentielles pour délivrer des substances directement dans le cerveau.
- Les méthodes traditionnelles peuvent provoquer des lésions cérébrales importantes et une délivrance inefficace des médicaments.
- Les aiguilles capillaires en verre offrent une solution pour un ciblage précis.
- Cette étude se concentre sur l'amélioration du processus de micro-injection.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode pour fabriquer des aiguilles en capillaires de verre ayant une lumière de 50 µm.
- Améliorer la précision de l'administration de médicaments dans les structures cérébrales profondes.
- Minimiser les lésions cérébrales pendant le processus d'injection.
Méthodes utilisées
- Production d'aiguilles en capillaire de verre avec un lumen de 50 μm.
- Remplissage de l'aiguille avec de l'huile minérale pour faciliter l'injection.
- Chargement de l'aiguille avec la substance souhaitée ou une suspension cellulaire.
- Injection de la substance à faible débit dans les zones cérébrales ciblées.
Résultats principaux
- La méthode permet un ciblage précis des substances dans le cerveau.
- Réduction significative des lésions cérébrales par rapport aux méthodes traditionnelles.
- Distribution efficace de médicaments, de vecteurs viraux ou de greffes cellulaires.
- Efficacité démontrée chez les modèles rongeurs.
Conclusions
- La technique développée améliore la précision des micro-injections.
- Elle fournit une méthode fiable pour l'administration de médicaments en recherche en neurosciences.
- Cette approche peut être appliquée à diverses substances, améliorant ainsi les résultats expérimentaux.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La délivrance précise d'agents thérapeutiques vers des structures cérébrales profondes demeure un défi majeur dans le développement de médicaments en neurosciences, en particulier chez les modèles animaux de petite taille où un traumatisme procédural peut fausser les résultats. Cette méthode de microinjection améliore la fidélité de l'interaction avec la cible en réduisant les lésions tissulaires induites par l'injection et la diffusion passive, améliorant ainsi la fiabilité des études d'interventions pharmacologiques et génétiques. L'approche permet une détection précoce des mécanismes à risque en phase de découverte initiale, en assurant une délivrance reproductible de faibles volumes de médicaments, de vecteurs viraux ou de greffes cellulaires, avec une variabilité biologique réduite.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet une interrogation précise des hypothèses thérapeutiques dans les noyaux cérébraux profonds en réduisant les effets hors cible dus au traumatisme de l'injection.
- Valeur opérationnelle : Assure une administration cohérente de composés ou d'outils génétiques d'une étude à l'autre, améliorant ainsi la reproductibilité des protocoles de validation ciblée.
- Fiabilité prédictive : Réduit la variabilité procédurale susceptible d'occulter de véritables réponses pharmacologiques ou biologiques.
Développement de criblage et de tests
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes biologiques validés avec une charge lésionnelle minimale pour des criblages de composés en aval dans les voies du système nerveux central.
- Valeur opérationnelle : Permet des injections standardisées et de faible volume (20–100 nl), adaptées à des formats de dosage à haute précision nécessitant un contrôle strict du profil pharmacocinétique.
- Réutilisation de la plateforme : Adaptable à diverses substances (médicaments, vecteurs viraux, cellules) en ajustant la taille de la lumière de l'aiguille, ce qui permet des campagnes de criblage multimodales.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Améliore la fidélité du modèle de maladie en réduisant les lésions perturbatrices liées aux procédures d'injection, augmentant ainsi la pertinence translationnelle.
- Valeur opérationnelle : Permet des interventions reproductibles dans les études longitudinales, facilitant les régimes de dosage chronique ou de greffe cellulaire.
- Progrès ajusté au risque : Renforce la confiance dans les données d'engagement de la cible, soutenant les décisions d'aller ou de ne pas aller de l'avant dans les programmes précliniques.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de la cible à l'optimisation du composé précurseur, où une administration précise au système nerveux central est essentielle pour évaluer la modulation de la cible et l'engagement de la voie métabolique.
- Biologie de la découverte : Permet de tester des hypothèses dans les structures cérébrales profondes en assurant une administration précise de sondes pharmacologiques ou génétiques.
- Écrans de composés : Assure une administration quantitative et reproductible pour l'évaluation de composés in vivo, essentielle pour les études de relation dose-réponse et d'occupation du site cible.
- Analytique : Génère des résultats fiables en réduisant le bruit induit par la procédure, améliorant ainsi la détection du signal dans les mesures de biomarqueurs ou d'efficacité.
- Recherche translationnelle : Favorise la continuité entre la phase de découverte et la phase préclinique en garantissant une administration cohérente et peu traumatisante tout au long des différentes étapes de l'étude.
- Réutilisation à l'échelle organisationnelle : Constitue une capacité standardisée et adaptable pour l'administration dans le système nerveux central, applicable à plusieurs projets et modalités.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique liée aux artéfacts d'injection.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et la standardisation entre laboratoires et études grâce à des paramètres définis de préparation des aiguilles et d'injection.
- Valeur stratégique : Optimise l'efficacité du capital en réduisant le nombre d'études infructueuses dues à la variabilité procédurale ou à des effets hors cible.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation plus fiable des cibles du SNC à partir de données pharmacologiques et génétiques plus précises.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Requiert une expertise en microchirurgie, en coordination stéréotaxique et en fabrication d'aiguilles à l'aide d'un tireur de pipettes et d'une microforge.
- Dépend de l'accès à des instruments spécialisés, notamment un cadre stéréotaxique, un microinjecteur et un microscope pour la visualisation de l'aiguille.
- Nécessite une standardisation de la taille de la lumière de l'aiguille (50 µm) et du protocole de remplissage (50 % d'huile minérale) afin d'assurer une performance constante entre les utilisateurs.
- L'adaptation à différents systèmes modèles peut exiger un ajustement des coordonnées et une validation de la profondeur de pénétration de l'aiguille.
- Les limitations pratiques incluent le niveau de compétence technique requis pour l'étirage et l'affûtage des aiguilles, ainsi que le faible débit inhérent à la microinjection manuelle.
