Imagerie différentielle des structures biologiques avec doublement résonnante anti-Stokes cohérente diffusion Raman (CARS)

Ce vidéo montre une procédure permettant d'effectuer une imagerie différentielle de deux résonances Raman associées à des structures biologiques à l'aide de signaux de diffusion Raman cohérente. Trois lasers à impulsions courtes synchronisés sont d'abord superposés dans le temps et l'espace. Les impulsions superposées sont ensuite envoyées vers un microscope inversé standard, ce qui permet la génération de signaux Raman cohérents à partir d'objets microscopiques.

Les signaux sont convertis en images à l'aide d'un logiciel commercial afin de comparer les différents signaux Raman produits. Les résultats indiquent que la différence entre les images obtenues à partir de signaux Raman doublement et simplement résonnants offre une sensibilité accrue pour les signaux Raman faibles. Bonjour, je suis Tyler Weeks du Centre de bio-photonique de l'Université de Californie à Davis.

Je suis Thomas ER du Centre de bio-photonique et du Département de médecine interne de l'Université de Californie à Davis. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure utilisant la diffusion Raman cohérente anti-Stokes doublement résonnante pour produire des images chimiquement spécifiques de cellules. Nous utilisons cette procédure pour détecter des signaux provenant de molécules trop faibles pour être détectés directement par spectroscopie Raman cohérente anti-Stokes seule.

Commençons. Afin de générer simultanément les signaux CARS et CARS-DG, trois sources laser à impulsions courtes accordables et synchronisées sont nécessaires pour obtenir ces impulsions synchronisées. Commencez avec un seul laser à impulsions courtes ayant une puissance de sortie de 10 watts, une longueur d'onde fixe de 1064 nanomètres, une durée d'impulsion fixe de sept picosecondes et une fréquence de répétition fixe de 76 mégahertz.

À l’aide d’une série de lames demi-onde et de cubes diviseurs de faisceau polarisants, le faisceau est divisé en trois parties. Une lame demi-onde combinée à un cube diviseur de faisceau polarisant permet d’ajuster la puissance dans chaque composante du faisceau sans en modifier la direction. Typiquement, deux faisceaux sont réglés à environ 4,5 watts chacun, et le troisième faisceau contient le watt restant.

Les deux faisceaux de haute puissance sont ensuite dirigés vers deux oscillateurs paramétriques optiques indépendants, ou OPO. Les OPO utilisent une génération de fréquences différentes pour convertir un photon à haute énergie en deux photons à énergie plus faible ayant des longueurs d'onde distinctes. En contrôlant la température du cristal utilisé pour obtenir cet effet, les longueurs d'onde des photons résultants peuvent être ajustées avec une précision de 0,1 nanomètre.

En doublant la fréquence de ces signaux, un laser à longueur d'onde fixe de 1064 nanomètres peut désormais être transformé en un faisceau laser accordable entre 780 nanomètres et 910 nanomètres, en pompant deux OPO distincts à l'aide de la même source de 1064 nanomètres. Deux sources laser indépendamment accordables sont ainsi obtenues, automatiquement synchronisées avec notre laser pompe d'origine. Le troisième faisceau provenant du laser pompe de 1064 nanomètres est dévié autour des OPO à l'aide d'une combinaison de miroirs diélectriques, de sorte que les trois faisceaux puissent être recombinés ultérieurement.

Pour produire efficacement des photons de signal Raman cohérents, les impulsions recombinées doivent être superposées à la fois dans le temps et dans l'espace, car les OPO contiennent des cavités en anneau permettant à chaque impulsion laser de traverser le cristal plusieurs fois ; le faisceau envoyé à travers les OPO parcourt ainsi une distance supplémentaire, entraînant un retard considérable par rapport au faisceau pompe d'origine. Cette distance doit être compensée à l'aide d'un troisième faisceau, en introduisant des miroirs supplémentaires qui forcent ce faisceau à parcourir la même distance que les deux autres avant qu'ils ne soient recombinés à l'aide de miroirs dichroïques afin d'assurer un réglage fin de la longueur du trajet. Chaque faisceau traverse des étages de retard réglables, qui permettent d'ajuster le recouvrement temporel des différentes impulsions laser.

Un autre ensemble de lames demi-onde et de cubes diviseurs de faisceau polarisants est ajouté à chaque faisceau afin de permettre l'ajustement indépendant de la puissance laser de chaque faisceau. Des miroirs dichroïques sont utilisés pour combiner d'abord les faisceaux provenant des deux OPO, puis le faisceau de 1064 nanomètres ; il est essentiel de veiller à ce que les faisceaux soient parfaitement superposés dans l'espace. Cette superposition peut être vérifiée en comparant le recouvrement des faisceaux à quelques centimètres du miroir dichroïque avec celui observé à environ un mètre du miroir dichroïque.

Étant donné qu'une exposition à des faisceaux laser de puissance moyenne élevée peut endommager l'échantillon, les trois faisceaux combinés sont dirigés à travers un modulateur électro-optique fonctionnant comme un sélecteur d'impulsions, ce qui permet d'ajuster la fréquence de répétition des impulsions arrivant sur l'échantillon, et donc la puissance moyenne. Les faisceaux laser combinés sont ensuite couplés à un microscope inversé équipé d'un objectif à haute ouverture numérique, ou NA. Le focalisation très serrée produite par l'objectif à haute NA permet la génération la plus efficace de signaux Raman cohérents à l'échelle microscopique.

L'objectif du microscope est monté sur une platine piézoélectrique X, Y, Z, ce qui permet d'obtenir des images en balayant les faisceaux sur l'échantillon selon un mode similaire à celui des microscopes confocaux commerciaux à balayage de faisceau. Voyons maintenant comment générer les signaux CARS et D-R-F-W-M : l'interaction de trois faisceaux laser à impulsions courtes au niveau de l'échantillon conduit à la génération de plusieurs signaux de mélange à quatre ondes, tels que les signaux CARS provenant des différentes combinaisons de deux lasers, ainsi que les signaux CARS tricolores et les signaux DR-CARS issus de la combinaison des trois lasers. Lorsque les signaux sont relativement proches en longueur d'onde, il peut être difficile de les séparer pour l'analyse.

Pour cette raison, les signaux sont envoyés vers un spectromètre d'imagerie qui sert également de monochromateur ou de filtre passe-bande afin de séparer spatialement les signaux à différentes longueurs d'onde. Un miroir basculant actionné électroniquement situé à l'intérieur du spectromètre, en position abaissée, dirige le signal vers une caméra CCD (dispositif à couplage de charge) à éclairage arrière et à appauvrissement profond, qui fournit des informations spectroscopiques sur l'ensemble du spectre de signal, et nous permet d'identifier et d'optimiser les différents signaux Raman cohérents afin de sélectionner le signal à imager. Il suffit de faire tourner le réseau dans le spectromètre à l'aide du logiciel de commande et d'acquisition de données fourni par le fabricant pour centrer le pic d'intérêt sur la caméra CCD.

Ensuite, modifiez la position du miroir basculant afin de rediriger le signal vers un deuxième port de sortie auquel est fixé un photodétecteur à avalanche à comptage de photons uniques DDE ou un PD. Effectuez une numérisation raster de l'objectif, puis utilisez les signaux enregistrés sur le PD pour générer une image en affichant le taux de comptage de photons pour chaque pixel à l’aide du logiciel d’acquisition de données. Répétez cette procédure d’imagerie pour chaque signal Raman cohérent souhaité afin que les signaux puissent être comparés lors du post-traitement.

Examinons maintenant comment préparer correctement un échantillon afin d'obtenir des images nettes et reproductibles. Un soin particulier doit être pris lors de la préparation des échantillons. Ces derniers sont généralement préparés sur des lamelles en verre d'une épaisseur d'environ 150 microns.

Ces lamelles sont suffisamment minces pour permettre une imagerie haute résolution à l’aide d’objectifs à immersion dans l’eau ou dans l’huile ayant un grand indice de réfraction (NA), utilisés dans ces expériences. Pour illustrer la préparation d’un échantillon typique, nous préparons des sections d’environ 20 micromètres d’épaisseur de tissu musculaire de souris fixé sur une lame de microscope. Une goutte de 20 microlitres de solution de glucose deutéré à cinq molaire est ajoutée à l’échantillon.

La solution de glucose deutérée fournit une signature de fond Raman unique et intense. Un lamelle en verre est placée au-dessus de l'échantillon et fixée à l'aide de vernis à ongles pour les cellules et la culture. Des boîtes de culture à fond en verre peuvent être utilisées, permettant l'imagerie sans avoir à détacher les cellules de leurs boîtes de culture initiales.

Examinons maintenant comment déterminer les pics et longueurs d'onde appropriés pour les voitures Dr. Afin de tirer pleinement parti de l'effet d'amplification doublement résonnant, les spectres Raman des deux substances résonnantes doivent être connus. Généralement, ces pics se situent à 2 845 cm⁻¹, associé aux lipides, et à 2 121 cm⁻¹, correspondant au mode d'étirement CD lié au glucose deutéré.

La diffusion Raman cohérente est obtenue lorsque la différence de fréquence entre deux lasers correspond à la fréquence d'une vibration moléculaire. En ajustant un OPO à 817 nanomètres, il sondéra le mode C à 2 845 centimètres inverses lorsqu'il sera combiné au faisceau laser de 1064 nanomètres, et en réglant l'autre OPO à 868 nanomètres, il sondéra le mode à 2 121 centimètre inverse lorsqu'il sera combiné au faisceau de 1064 nanomètres. En mode spectroscopique, le microscope CARS nous permet d'observer trois signaux Raman cohérents d'intérêt : un signal CARS sondant la vibration d'élongation CH, un signal CARS sondant le mode d'élongation CD, et un signal DR CARS sondant les deux. Dans le schéma présenté ici, les flèches en pointillés indiquent les photons provenant des lasers des OPO, tandis que les flèches pleines indiquent le signal résultant.

Les lignes horizontales continues indiquent l'énergie de la vibration ramen et offrent une représentation visuelle du fait que, dans les voitures DR, le mélange simultané des trois mêmes photons d'entrée sonde deux vibrations ramen différentes. L'intensité du signal pour chaque pic devra être optimisée en effectuant des réglages fins autour de ces positions de pics. Ici, nous sélectionnons chaque pic et prenons des images de vers marins elgan dans une solution de glucose deraté, l'extraction d'informations supplémentaires à partir de ces trois images obtenues individuellement nécessitant un traitement d'image assez simple.

Tout d'abord, les images doivent être normalisées. Une méthode pratique de normalisation repose sur le fait que les lipides sont hydrophobes. Cela signifie que dans les régions où la densité des lipides est élevée, la résonance CD issue du glucose devrait contribuer très peu au signal de double résonance.

En revanche, dans les régions contenant uniquement une solution de glucose, les résonances CH provenant des lipides devraient également contribuer très peu. Dans cette optique, normalisez l'image du car DR et l'image du car obtenue sur la résonance CD de la solution de glucose deutérée à une région située bien au-delà du ver CL egan, qui ne devrait présenter aucune résonance CH. Ensuite, identifiez une région située à l'intérieur du ver sur l'image du car en résonance CH riche en lipides, et normalisez-la par rapport à la région correspondante dans l'image normalisée du car DR.

Pour que cette méthode fonctionne correctement, on suppose qu’en profondeur dans cette région, aucun glucose deutéré n’est présent. Cette hypothèse est raisonnable puisque les lipides sont hydrophobes et ne se mélangent pas à la solution. En soustrayant ensuite l’image normalisée du carbone lié à l’hydrogène (CH) de l’image normalisée du carbone lié au deutérium (CD), seul le signal résonnant amplifié du CD subsiste, de manière analogue à la soustraction de l’image normalisée du carbone lié au deutérium (CD) de l’image normalisée de Dr.FWM.

Seul le signal résonnant CH amplifié reste visible. Voici le spectre Raman pour un acide oléique modifié incluant une modification alkyne : les résonances CH intenses à 2 845 cm⁻¹ et la résonance alkyne à 2 121 cm⁻¹ sont toutes deux bien isolées de la région d'empreinte digitale, correspondant à la zone aux pics densément groupés, ce qui les rend idéales comme marqueurs pour l'imagerie Raman cohérente. Il s'agit d'un spectre typique de signaux Raman cohérents générés lorsque trois lasers à impulsions courtes se superposent dans l'échantillon. Les flèches indiquent les processus responsables de chaque signal, tels qu'illustrés par les diagrammes d'énergie.

Il s'agit de résultats typiques obtenus par imagerie des vers de C. Elgin à l'aide de voitures DR et de voitures. La rangée supérieure a utilisé les trois signaux précédemment montrés pour imager un ver dans une solution de glucose atténué. Dans la deuxième rangée, les images ont été correctement normalisées et, dans la troisième rangée, les images de différence ont été produites en soustrayant l'image de chaque voiture de l'image de la voiture DR. Nous venons de vous montrer comment réaliser une imagerie de différence Raman basée sur la microscopie cohérente anti-Stokes Raman doublement résonante.

Lorsque vous effectuez cette procédure, souvenez-vous qu'il est important de vous assurer que les faisceaux sont correctement superposés et synchronisés. De plus, lors du passage d'un signal cohérent à un autre, veillez à ne pas heurter ni déplacer l'échantillon, car cela affecterait l'analyse. Voilà tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.