Une méthode pour isoler l'îlot murin et transplantation rénale sous-capsulaires

La transplantation d'îlots a été proposée comme traitement potentiel du diabète de type 1. Toutefois, deux limitations majeures empêchent sa généralisation en pratique clinique. Premièrement, un grand nombre d'îlots est nécessaire par receveur.

Étant donné que les îlots sont obtenus à partir de donneurs d'organes, le nombre de receveurs potentiels est fortement limité. Une deuxième transplantation nécessite un traitement à vie par des immunosuppresseurs puissants, ce qui expose le patient, en particulier la population pédiatrique, à un risque accru de malignité, d'infection et d'insuffisance rénale. La transplantation d'îlots sous la capsule rénale de la souris est réalisée afin d'étudier des stratégies visant à améliorer les résultats cliniques de la transplantation.

Des îlots isolés de souris donneurs saines sont répartis en groupes et préparés pour la transplantation. Ces îlots sont ensuite transplantés dans l'espace sous-capsulaire du rein. Chez les souris receveuses diabétiques, la fonction des greffons d'îlots est évaluée par le suivi des taux de glucose sanguin, ce qui montre qu'environ 250 à 350 îlots permettent de rétablir une glycémie normale chez une souris receveuse de 20 grammes dans les 24 heures suivant la transplantation.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle pour les étapes de canulation. La canulation du canal cholédoque et le transfert des oeillets dans l'espace sous-capsulaire du rein sont difficiles à apprendre. Ces étapes exigent l'identification de structures tissulaires, une main ferme et l'utilisation d'une technique qui minimise les lésions tissulaires.

Placer une souris euthanasiée en position dorsale sur une serviette en papier sous le microscope stéréoscopique et pulvériser l'abdomen avec de l'éthanol à 70 %. Utiliser des ciseaux pour ouvrir l'abdomen selon une incision en forme de V, allant de la région pubienne aux deux pattes antérieures. La souris se trouve sous le microscope stéréoscopique.

Positionnez-le de manière à ce que la tête soit orientée vers l'observateur. Localisez l'entrée duodénale du canal cholédoque à l'aide d'une pince hémostatique, correspondant à l'orifice duodénal du canal cholédoque. La pince hémostatique doit être positionnée de sorte que, lorsqu'elle est comprimée, elle suive exactement la limite entre le pancréas et l'intestin.

Ici, deux méthodes pour canuler le canal biliaire seront démontrées : la méthode à main libre et la méthode assistée par forceps pour canuler le canal biliaire. En utilisant la méthode à main libre, tirez l'hémostat fixé sur le duodénum loin de la tête de la souris vers la queue afin que le canal biliaire commun devienne tendu.

Il existe une confluence dans le canal biliaire près du foie, où la bile provenant de la vésicule biliaire et les enzymes provenant du foie se rejoignent. Avant d'entrer dans les intestins, tendez le canal biliaire afin d'exposer l'intérieur de la position en V. Utilisez une aiguille courbée de 27 gauge fixée à une seringue de cinq millilitres, de sorte que l'aiguille traverse exactement la position en V et canule directement la partie inférieure du canal. Faites glisser l'aiguille de plusieurs millimètres au-delà de l'extrémité du biseau afin d'empêcher tout reflux vers le foie et la vésicule biliaire.

Une fois la canulation réussie, perfuser le pancréas en administrant deux millilitres de liase à partir de la seringue. Observer l'expansion du pancréas au-dessus de l'estomac comme indicateur d'une canulation optimale. Alternativement, on peut réaliser la canulation du canal biliaire.

En utilisant la méthode de la vessie à forceps. Tirez l'hémostat C fixé sur le duodénum, en l'éloignant de la tête de la souris vers la queue, de sorte que le canal cholédoque devienne tendu. Puis, à l'aide d'une aiguille courbée de 27 gauge fixée à une seringue de cinq millilitres, percez la fascia située sous le canal cholédoque, près du foie.

Utilisez l'aiguille pour dégager l'aponévrose du canal avec l'aiguille toujours en place. Posez le clamp et prenez une paire de forceps. Utilisez un bras des forceps ouverts pour soutenir le canal biliaire à l'endroit où l'aiguille a dégagé l'aponévrose, tout en tirant doucement le canal et les forceps vers l'avant.

Faites glisser l'aiguille dans le canal en utilisant la pince comme butée. Une canulation réussie se manifeste par une expansion régulière de la région du pancréas située au-dessus de l'estomac. Une fois le pancréas perfusé, retirez l'hémostat du duodénum.

Ensuite, utilisez la pince pour soulever le duodénum et une deuxième paire de pinces pour séparer le pancréas des intestins. Puis, détachez le pancréas du sommet de l'estomac et de la rate. Enfin, soulevez le pancréas hors de l'abdomen et coupez-le des connexions restantes aux fascias de l'intestin, de l'estomac et de la rate.

Placer le pancréas dans un tube conique de 50 millilitres et le mettre sur de la glace. Incuber le pancréas à 37 degrés Celsius selon les instructions du protocole écrit joint. Après l'incubation, ajouter 20 millilitres de milieu dans les tubes et dissocier le tissu en agitant vigoureusement les tubes 40 fois en 10 secondes.

Cette étape est cruciale pour une récupération optimale des violettes. Faire centrifuger les cellules à 800 tours par minute. Resuspendre dans 15 millilitres de milieu et concentrer les échantillons.

Verser la suspension à travers une maille métallique de 0,419 millimètre et l’acheminer dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Rincer le premier tube avec 10 millilitres supplémentaires de milieu contenant 10 % de sérum de veau fœtal, puis verser à travers la maille métallique. Pelletiser les cellules par centrifugation. Resuspendre le culot dans 5 millilitres de milieu opaque H10 77 à température ambiante. Vortexer doucement pendant plusieurs secondes. Ajouter 5 millilitres supplémentaires de milieu opaque en rincant les parois internes du tube pour détacher les cellules. Pipeter lentement afin de superposer 10 millilitres de RPMI sans sérum le long de la paroi du tube à un débit d’un millilitre toutes les 10 secondes.

Une interface nette doit être visible. Ensuite, faire centrifuger les échantillons dans une centrifugeuse à godets oscillants à 20 degrés Celsius et 900 fois la gravité pendant 20 minutes, avec une accélération très lente et sans freinage après la centrifugation. Les îlots seront séparés des cellules exocrines à l’aide d’une pipette sérologique jetable de 10 millilitres. Transférer les îlots depuis l’interface du milieu HistoPaque vers un nouveau tube conique de 50 millilitres.

Plusieurs tubes peuvent être regroupés à ce stade pour éliminer les résidus de manchons, remplir ces tubes opaques avec un milieu contenant du sérum et faire précipiter les îlots par centrifugation des tubes pendant deux minutes à 800 tours par minute. Ensuite, resuspendre les îlots dans un milieu frais. Répéter cette étape au moins deux fois. Reus.

Suspendez la pastille dans cinq millilitres de milieu. Placez un filtre à cellules en nylon de 0,1 millimètre à l’envers sur un tube conique de 15 millilitres. Prélevez la suspension cellulaire à l’aide d’une pipette et faites-la passer à travers le filtre pour recueillir les œillets.

Ensuite, rincez le tube de 50 millilitres avec six millilitres supplémentaires de milieu et faites-le passer à travers le filtre. Placez une goutte de milieu de trois millilitres dans une boîte de Pétri de 10 centimètres. Retournez le filtre à cellules et plongez-le dans la goutte de milieu pour récupérer les œilletons ; pipetez cinq à sept millilitres supplémentaires de milieu de culture à travers le filtre dans la boîte de Pétri.

Pour récupérer les éventuels œillets restants dans le filtre sous un objectif grossissant quatre fois, prélevez les œillets individuellement à l’aide d’une pipette P200 et transférez-les dans un tube microfuge de 1,5 millilitre. Ces images montrent des œillets isolés de souris C57BL/6 âgées de 12 semaines. La pureté et la qualité des œillets peuvent être estimées au microscope une fois la procédure d’isolement terminée.

Par exemple, les deux images présentées ici montrent un champ représentatif où sont présents des débris et une contamination par des cellules exocrines. Lors du choix des îlots pour une expérience, évitez de sélectionner des cellules exocrines contaminantes ou des îlots dont l'aspect est anormal. Les îlots présentant des centres nécrosés sont anormaux, comme le montre cette figure prise 24 heures après l'isolement ; les centres nécrosés ne seront pas visibles immédiatement après l'isolement.

Les œillets constitués de cellules desquamées sont inévitables et peuvent être utilisés dans la greffe d'œillets, comme le montre cette vidéo en accéléré sur 24 heures. Immédiatement après l'isolement, des centres nécrotiques se développent au sein de nombreux œillets. Ces centres nécrotiques semblent être expulsés de l'œillet vers la fin de l'enregistrement, lors du prélèvement des œillets.

Les regrouper de manière à ce que chaque tube présente une répartition uniforme de la qualité et de la taille des ocelles. Par exemple, chaque groupe de 15 ocelles pourrait contenir quatre ocelles de grande taille, six ocelles de taille moyenne et cinq ocelles de petite taille. Placer le tube sur de la glace ; les ocelles peuvent être utilisés immédiatement pour la transplantation ou manipulés.

Avant utilisation. Insérez une pipette stérile pour chargeage de gel dans l'ouverture d'un tube microfuge de 1,5 millilitre de manière à former une légère courbure, créant ainsi une forme en U à l'extrémité étroite de la pipette. Les deux ouvertures de la pipette doivent être orientées directement vers le haut, au-dessus du tube microfuge.

Retirez délicatement un tube d'yeux de glace. Assurez-vous que tous les yeux se sont déposés au fond du tube. À l'aide d'une pipette P200, prélève délicatement les yeux en volume minimal depuis le fond du tube et transférez-les vers l'embout courbé préparé.

Une fois que les embouts ont sédimenté, retirez autant que possible le milieu à partir de l'extrémité en aspirant le milieu à travers l'ouverture large de l'embout de chargement de gel contenant les îlots, à l'aide d'un embout de chargement de gel neuf fixé à une pipette P200. Fixez l'extrémité non biseautée du tube à l'ouverture étroite de l'embout de chargement de gel contenant les îlots. Ensuite, fixez l'embout à une pipette P200 et poussez délicatement les îlots dans le tube.

Ensuite, reliez le bord non biseauté du tube PE 50 à l'aiguille d'une seringue Hamilton de 25 microlitres. Avec le piston retiré, appuyez sur le piston de la seringue jusqu'à ce que les ocelles soient situés à environ 0,5 centimètre de l'ouverture biseautée. Mettez la seringue de côté afin que les ocelles puissent s'agglomérer en une masse unique près de l'ouverture biseautée du tube, pendant que le rein est préparé pour recevoir les ocelles.

Préparez le site chirurgical en rasant les poils et en nettoyant la peau avec du Bétadine en alternance avec de l'alcool isopropylique à 70 %, trois fois. Commencez la procédure de transplantation de l'anneau en effectuant une pincée au niveau de l'orteil afin de confirmer l'anesthésie chez la souris receveuse. Placez la tige d'une tige en verre directement sous la souris et en dessous du rein, perpendiculairement à la moelle épinière.

Ensuite, localisez le rein à travers la peau et placez un champ chirurgical stérile. Une fois le rein localisé, utilisez des ciseaux McFerson banis pour pratiquer une incision de deux centimètres à travers le derme directement au-dessus, perpendiculairement à la moelle épinière. Cette incision exposera la paroi péritonéale avec les ciseaux.

Réalisez une incision d’un centimètre à travers la paroi péritonéale dans le même sens que celle pratiquée dans la couche dermique, en utilisant la tige de la tige en verre comme butée arrière, puis faites sortir le rein par l’ouverture péritonéale en appuyant vers le bas sur la surface adjacente. Humidifiez la surface du rein exposé avec du PBS stérile glacé à l’aide d’un applicateur en coton imbibé. Répétez cette étape toutes les quelques minutes selon les besoins afin d’éviter que la capsule du rein ne s’assèche.

À l’aide d’une aiguille de calibre 27, réalisez une incision de 0,2 centimètre à travers la capsule rénale sur la face antérieure du rein. En partant du côté latéral gauche vers le côté latéral droit, insérez un tube capillaire en verre étiré à la flamme. Introduisez-le par l’incision précédemment réalisée et déplacez-le en direction postérieure le long de la surface dorsolatérale du rein.

Pour créer une poche entre la capsule rénale et le parenchyme rénal, déplacez les orifices de la seringue Hamilton de 25 millilitres préparée jusqu'au bord extrême de l'ouverture biseautée du tube flexible. Insérez ensuite le bord biseauté, orienté vers le haut, dans la poche sous-capsulaire. Le bord long est en contact avec le parenchyme rénal.

Déplacez le tube jusqu'à l'extrémité postérieure la plus reculée de la capsule. Ensuite, transférez lentement les ocelles du tube PE 50 dans la poche sous-capsulaire en appuyant sur le piston de la seringue. Au fur et à mesure que les ocelles remplissent la poche, retirez progressivement le tube souple pour libérer davantage d'espace.

Après avoir retiré le tube du sac, faites glisser la sonde en verre le long de la surface externe du rein, de l'avant vers l'arrière, afin de repousser délicatement les œilletons dans l'extrémité proximale du sac. À l'aide de pinces à branches coudées, soulevez le revêtement péritonéal adjacent à l'ouverture pratiquée pour le rein. Ensuite, utilisez un applicateur en coton imbibé de PBS pour repousser doucement le rein à l'intérieur de la cavité péritonéale.

Fermer la souris en appliquant des points de suture sur la paroi péritonéale et des agrafes cutanées sur la couche dermique. Replacer la souris dans sa cage et la surveiller. Pour la récupération, de l’eau acétominée doit être fournie pour le tube digestif de la souris.

Des œillets de souris C ont été isolés. En utilisant les méthodes décrites dans cette vidéo, une dose curative a été transplantée chez des souris allogéniques C57BL/6. Les taux de glucose sanguin non à jeun ont été surveillés à partir du premier jour suivant l'intervention chirurgicale.

Le rejet est observé vers le jour 17 chez des souris réceptrices de 20 grammes ayant reçu 300 œillets d'un donneur allogénique. Ici, la récupération a été surveillée chez des souris ayant reçu soit 150 œillets, soit 300 œillets de donneurs syngéniques. Aucun rejet n'est observé dans ces greffes, car les œillets proviennent de donneurs syngéniques.

La dose d’implants oculaires administrée mesure la fonction principale des implants immédiatement après la transplantation. Une récupération marginale a été observée avec 150 implants oculaires, tandis qu'une récupération complète a été obtenue lors de la transplantation de 300 implants oculaires. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension des étapes critiques nécessaires pour isoler les implants oculaires de souris et les transplanter dans l’espace sous-capsulaire du rein.

Avec de la pratique, vous développerez la capacité de canuler rapidement le canal cholédoque, ce qui constitue l'étape la plus difficile de ce protocole.