Analyse du génome entier en utilisant ChIP d'identifier les gènes cibles spécifiques Isoform

L'objectif général de l'expérience suivante est d'identifier les cibles génomiques de la déméthylase d'histone KDM cinq a Jared un, une RBB deux. Cela est réalisé par la préparation de chromatine réticulée qui est soniquée afin de produire des fragments d'ADN de taille appropriée, lors d'une deuxième étape. Les fragments d'ADN liés à la RBB deux sont immunoprécipités à l'aide d'anticorps dirigés contre la RBB deux.

Ensuite, l'ADN génomique récupéré est amplifié par PCR en vue du séquençage. Enfin, les courtes lectures séquencées par Illumina sont alignées de manière unique sur le génome humain, et des pics significatifs sont identifiés et annotés en fonction des gènes les plus proches. Afin d'identifier les deux gènes cibles de Rbbb, des résultats sont obtenus qui montrent des fonctions moléculaires associées aux gènes cibles de Rrb B deux, sur la base de l'identification à l'échelle du génome de régions enrichies en Rbbb deux.

Bonjour, je suis Mike. Elle provient du laboratoire de la Dre Elizabeth Bencia, du Département de biochimie et de génétique moléculaire de l'Université de l'Illinois à Chicago. Et je suis ala du laboratoire de génomique biomédicale dirigé par la Dre NGA au parc de recherche biomédicale BARCEL, université PO P fea.

Et je suis Danielle Dal. Et je suis William Richter. Nous faisons tous deux partie du laboratoire de compétences Benevolence Skill Lab.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure d'immunoprécipitation de la chromatine et de séquençage. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier le site de fixation de son dermatologue. Commençons donc.

Pour commencer cette procédure, cultiver environ 10 puissance huit cellules pour chaque immunoprécipitation ou IP. Ici, lymphome ostéolytique diffus.

Des cellules U 937 sont utilisées et induites pour une différenciation monocytique avec le TPA pendant 96 heures après la croissance cellulaire, puis une solution de formaldéhyde est ajoutée directement dans le milieu pour obtenir une concentration finale de 1 %. Ensuite, agiter brièvement le flacon et laisser reposer à température ambiante pendant 10 minutes. Puis aspirer le milieu et rincer les cellules avec 15 millilitres de PBS glacé. Répéter ce lavage une fois.

Ensuite, ajoutez six millilitres de tampon de lyse un à chacun des flacons placés sur de la glace. Agitez ensuite doucement les flacons pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Enfin, récoltez les cellules à l’aide d’un grattoir à cellules et transférez-les dans des tubes coniques de 15 millilitres.

À ce stade, les cellules peuvent être conservées à moins 80 degrés Celsius. Si les cellules ont été congelées, les décongeler. Une fois décongelées, centrifuger les cellules et éliminer le surnageant.

Ensuite, resuspendre les cellules dans six millilitres de tampon de lyse deux, agiter doucement les tubes à température ambiante pendant 10 minutes. Répéter la centrifugation et resuspendre les cellules dans 2,5 millilitres de tampon de lyse trois. Préparer ensuite la suspension pour la sonication en la plaçant dans un bécher d’eau glacée avec la microsonde d’un Branson 450 réglée entre 50 et 60 % d’amplitude.

Soniquez la solution pendant une rafale constante de 32 secondes et refroidissez sur de la glace. Répétez ces impulsions pendant une minute, de 10 à 15 fois, puis aspirez et redistribuez le contenu du tube à l’aide d’une pipette, et transférez-le dans un nouveau tube. Poursuivez par des impulsions et le refroidissement de la solution.

Cinq fois supplémentaires après la sonication, ajouter du Triton X-100 à 10 % jusqu'à un dixième du volume de la solution. Ensuite, transférer les lysats dans des tubes de centrifugation de 1,5 millilitre et éliminer les débris par centrifugation dans une microcentrifugeuse avant la chromatine, l'immunoprécipitation ou le « chip ». Conserver 50 microlitres du lysat cellulaire comme échantillon d'entrée.

Ensuite, combiner le lysat cellulaire clarifié avec des billes Dyna liées à un anticorps qui avaient été préparées précédemment selon le protocole écrit. Agiter doucement le mélange ainsi que l'échantillon d'entrée de 50 microlitres à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Laver les billes avec un millilitre de tampon de lavage.

Ensuite, utiliser un support magnétique pour récupérer les billes et éliminer le surnageant. Répéter ce lavage de six à huit fois. Effectuer un lavage final avec un millilitre de tampon TE additionné de 50 millimolaires de chlorure de sodium.

Faites tourner les billes dans une microcentrifugeuse après la centrifugation, aspirez tout tampon TE résiduel. Ajoutez ensuite 100 microlitres de tampon d'élution aux échantillons. Immédiatement après.

Incuber les échantillons à 65 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes. Gratter les tubes contre un support pour tubes de 1,5 millilitre toutes les deux minutes afin de maintenir les billes en suspension. Récupérer les billes par centrifugation et à l’aide du support magnétique, puis transférer le SNAT dans un tube PCR.

Ensuite, récupérez l'échantillon témoin précédemment conservé et ajoutez trois volumes du tampon d'élution. Enfin, placez les échantillons d'IP et témoin dans le thermocycleur pendant toute la nuit à 65 degrés Celsius. Le lendemain, pour inverser les liaisons de réticulation, ajoutez un volume de tampon TE aux échantillons.

Ensuite, ajouter les ARN A à une concentration finale de 0,2 microgramme par microlitre. Incuber les échantillons dans le thermocycleur pendant une à deux heures à 37 degrés Celsius. Après l'incubation, ajouter la protéinase K à une concentration finale de 0,2 microgramme par microlitre.

Incubez ensuite les échantillons dans le thermocycleur à 55 degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, extrayez les échantillons une fois avec un volume de phénol. Extrayez les échantillons une deuxième fois avec un volume de phénol chloroforme alcool isoamylique.

Enfin, extraire une fois de plus les échantillons avec un volume de chloroforme-isoamyl alcool. Ajouter ensuite 30 microgrammes de glycogène à chaque échantillon. Ajouter également du chlorure de sodium à une concentration finale de 0,2 molaire et deux volumes d'éthanol aux échantillons.

Incubez-les pendant 30 minutes à moins 80 degrés Celsius. Après l'incubation, centrifugez les échantillons et décantez le surnageant. Lavez les culots avec 500 microlitres d'éthanol à 75 %, puis séchez les culots et redispensez-les dans 40 microlitres d'eau.

Pour vérifier la taille des fragments d'ADN produits par le protocole de SONICATION, chargez cinq microgrammes de l'échantillon d'entrée purifié sur un gel d'agarose à 1,8 % et faites migrer le gel. Le protocole de sonication devrait produire des fragments dont la taille se situe entre 150 et 350 paires de bases. Toutefois, si les fragments ne se situent pas dans cette plage, le protocole de sonication doit être ajusté en modifiant le nombre d'impulsions et l'amplitude avant l'amplification de l'ADN génomique.

Vérifiez la taille, la concentration et l'enrichissement des échantillons comme décrit dans le protocole écrit. Pour commencer l'amplification de l'ADN génomique, prélevez 34 microlitres de l'échantillon IP et 200 nanogrammes de l'échantillon d'entrée. Effectuez la réparation, l'ajout d'une queue poly-A et la ligation d'adaptateurs aux fragments d'ADN à l'aide d'un kit de préparation d'échantillons d'ADN génomique Illumina, tel que décrit dans le protocole écrit.

Purifiez l'ADN à l'aide d'un kit de purification PCR mini lut, puis éluésez-le dans un tampon EB préalablement réchauffé à 50 degrés Celsius. Utilisez respectivement 23 microlitres et 46 microlitres pour les échantillons d'ADN IP et d'entrée. Préparez la réaction PCR en utilisant 23 microlitres d'ADN avec les adaptateurs, 25 microlitres de fusion, et la polymérase ADN provenant du kit.

Un microlitre de PCR unique à 20 micromolaire un et un microlitre de PCR unique à 20 micromolaire deux ; effectuez la réaction de PCR comme décrit dans le protocole écrit. Après l'amplification par PCR, purifiez l'ADN à l'aide du kit de purification PCR Qiagen mini loop.

Préchauffez 15 microlitres de tampon EB à 50 degrés Celsius et diluez l'ADN en diluant 0,5 microlitre de l'échantillon d'un à quatre, puis effectuez une mesure au NanoDrop afin de purifier les produits amplifiés. Préparez un gel d'AGAROSE à 1,8 % de 50 millilitres en utilisant de l'eau de qualité HPLC, ajoutez du TAE et du bromure après que l'agarose soit fondue. Versez ensuite le gel et chargez-le.

Après avoir ajouté quatre microlitres de tampon de charge aux échantillons d'entrée et d'IP, faire migrer le gel à 120 volts pendant 45 minutes. Analyser le gel après électrophorèse. Cela doit révéler la production de fragments compris entre 150 et 350 paires de bases.

Ils représentent des fragments d'ADN génomique compris entre 50 et 250 paires de bases de longueur. Et un adaptateur, excisez la région du gel contenant le matériau dans la plage de 150 à 350 paires de bases à l’aide d’un scalpel. Veillez à ne pas exciser la bande d’adaptateur, qui migre à environ 120 paires de bases.

Récupérez l'ADN à l'aide d'un kit d'extraction rapide sur gel Kayak, conformément aux instructions du fabricant. Sèchez l'échantillon jusqu'à exactement 11 microlitres dans un évaporateur rapide sans chauffage. Prélevez un microlitre de l'échantillon et mesurez la concentration d'ADN à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop.

Enfin, identifiez les produits génétiques enrichis à l’aide de l’analyseur génomique Illumina et analysez les sites de fixation et les gènes cibles comme décrit dans le protocole écrit. Les coordonnées génomiques des régions enrichies de fixation de la protéine liant l’ARN deux ou RBP deux sont présentées selon un format réparti par chromosome. Les occupances des gènes de l’ensemble sur les chromosomes peuvent être visualisées sous forme de VAR noirs.

Ici, les occupations du chromosome 10 sont indiquées ; deux régions de liaison de rbp sont représentées par des lignes verticales. Le panneau central montre toutes les régions de liaison des isoformes de rbp deux sur le chromosome 10, et le panneau inférieur montre les régions de liaison de la grande isoforme de rbp deux. Ces informations fournissent un aperçu des occupations superposées et spécifiques des isoformes de RBP deux sur le chromosome 10.

Ici, une carte thermique est présentée avec les catégories de fonction moléculaire de l'ontologie génique (GO) enrichies de manière significative, corrigées pour le taux de faux positifs (FDR), parmi les gènes liés par la protéine RBP. Deux nuances proches du rouge indiquent une forte signification statistique. Le jaune indique une faible signification statistique, et le gris indique une absence de signification statistique.

L'analyse d'enrichissement montre les fonctions moléculaires communes et spécifiques aux isoformes des gènes cibles du facteur de transcription R BP deux. Nous venons de vous montrer comment identifier les sites de fixation des facteurs de transcription au cours de cette procédure. Il est important d'obtenir des fragments d'ADN d'une taille appropriée et d'un rendement suffisant.

Cela peut être réalisé en suivant nos directives lors de l'étape de SÉLECTION. Voilà donc tout. Bonne chance avec vos expériences et merci d'avoir regardé.