Enregistrements Patch Clamp à partir de neurones rétiniens souris dans une préparation adaptés à l'obscurité Slice

Notre expérience visuelle commence lorsque le pigment visuel présent dans les photorécepteurs de notre rétine absorbe des photons d'énergie lumineuse, entraînant finalement la fermeture des canaux activés par les nucléotides cycliques dans la membrane cellulaire. Cela supprime la libération du neurotransmetteur glutamate à partir des bâtonnets et des cônes. Le glutamate libéré est détecté par les cellules rétiniennes en aval afin d'étudier les signaux en aval.

Les yeux sont prélevés sur une souris euthanasiée. Les S sont isolés, inclus dans un bloc d'agar et sectionnés à l'aide d'un microtome vibrant. Ensuite, les sections rétiniennes sont placées sous un microscope et stimulées à l'aide d'un éclairage LED.

Alors que les enregistrements en configuration patch clamp sont effectués pour mesurer les courants ou potentiels synaptiques générés, les personnes novices dans cette méthode éprouvent généralement des difficultés en raison de la complexité accrue liée au travail dans l'obscurité. Ainsi, pouvoir visualiser l'ensemble du processus permettra d'acquérir une sensation qu'il est autrement difficile de décrire.

Commencez cette procédure en recouvrant les électrodes en fil métallique d'enregistrement et de référence qui seront utilisées d'une couche de chlorure d'argent. Plongez les électrodes dans du chlorure de sodium à une molaire. Ensuite, à l'aide d'une source d'alimentation de 15 volts avec une onde sinusoïdale de 1 hertz, appliquez 15 volts entre elles pendant environ 20 secondes.

À l’aide d’un tireur de micropipettes, préparez des pipettes de patch à partir de verre de silice BO poli au chalumeau, en choisissant une résistance de tip de pipette en fonction de la taille des cellules cibles dont les corps cellulaires ont environ 20 micromètres de diamètre. Utilisez une pipette avec une résistance de tip de cinq à 10 mégohms pour les corps cellulaires. Pour des cellules d’environ cinq micromètres de diamètre, utilisez une résistance de tip de 12 à 15 mégohms.

Pour préparer les électrodes de référence au sol, utilisez une seringue pour remplir un tube en polyéthylène avec une solution d'agar à 3,5 % préparée dans du chlorure de sodium à un millimolaire. Ensuite, préparez les solutions suivantes selon les instructions du protocole écrit joint : solution bain externe, solution de découpe, solution interne de pipette à aspartate de potassium et butée en agar.

Conserver toutes les solutions à quatre degrés Celsius jusqu'à leur utilisation. Le jour de l'expérience, prélever environ 1,5 millilitre de solution interne à base d'aspartate de potassium. Puis ajouter le Fluor dilué.

Verser environ 50 millilitres de milieu aims contenant du bicarbonate de sodium dans un récipient de stockage étanche à la lumière. Relier le tube en plastique à une bouteille de gaz contenant 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’oxygène afin d’équilibrer le milieu aims avec le gaz, puis placer le récipient dans un bain d’eau à 30 à 32 degrés Celsius. Ensuite, remplir une bouteille avec 110 millilitres de milieu aims contenant les pois et la placer sur de la glace.

Équilibrez le milieu en faisant barboter la solution avec du gaz oxygène à 100 %. Placez le milieu aimes restant contenant du bicarbonate de sodium dans un réservoir chauffé placé au-dessus de la cage de Faraday. Enveloppez du paraforme autour du tube et du bouchon de la bouteille pour piéger le gaz dans l'espace au-dessus de la solution et l'équilibrer avec un mélange de 5 % de gaz carbonique et 95 % d'oxygène.

À l’aide d’un tube de dispersion d’air en verre, préparez de l’agarose à faible température de gélation à 3 % en ajoutant 0,75 gramme à 25 millilitres de milieu AIMs sous forte chaleur. La solution atteint environ 115 degrés Celsius sous agitation. Lorsque la solution devient limpide et sans bulles, placez la solution d’agarose fondue dans un bain-marie à 42 degrés Celsius.

Installez la chambre d’enregistrement sur le microscope inversé. Faites glisser un pont d’agarose de cinq centimètres sur l’électrode de référence en argent/chlorure d’argent et positionnez-le dans la chambre d’enregistrement. La résistance de la pointe de la pipette peut être mesurée en remplissant une pipette avec la solution interne, en la plaçant sur le porte-pipette, en insérant le porte-pipette dans le support amplificateur, puis en abaissant la pipette dans la solution. Pour préserver le pigment visuel lors des enregistrements physiologiques, toutes les procédures doivent être effectuées sous lumière infrarouge à l’aide de lunettes infrarouges, bien que toutes les étapes soient ici illustrées en lumière ambiante.

Après l'euthanasie de la souris, utilisez des ciseaux courbes pour retirer rapidement les yeux. Placez les yeux sur un morceau de papier filtre afin d'empêcher qu'ils ne roulent. Ensuite, maintenez un œil en place avec une pince et utilisez une lame fine double tranchant pour pratiquer une fente dans la cornée.

Dès que le globe oculaire est perforé, transférez l’œil dans une boîte de Pétri de 60 millimètres remplie de milieu AIMs. En utilisant l’incision dans la cornée comme point d’entrée, utilisez de petites ciseaux pour découper les parties restantes de la cornée.

Ensuite, retirez le cristallin et l'humeur vitrée, en veillant à ce que la rétine reste attachée à la cupule oculaire. Placez-la dans un récipient imperméable à la lumière rempli de milieu AIMs équilibré avec 5 % de dioxyde de carbone dans 95 % d'oxygène à 32 degrés Celsius.

Ensuite, sectionner l'hémisphère à l'aide d'une lame de bistouri n°10 sur l'une des coupes oculaires. Séparer la rétine de l'épithélium pigmentaire rétinien.

Retirez les bords de la rétine pour permettre au tissu de s'aplatir. Utilisez une petite pipette en verre pour pâtes munie d'une poire en latex pour remplir une boîte de Pétri de 35 millimètres avec de l'agar fondu à faible température de gélification, puis faites glisser la pince dans l'agar pour en tester la consistance. Dès que l'agar commence à durcir, transférez la rétine sur la surface de l'agar.

Ensuite, sans toucher à la rétine, utilisez un morceau de papier absorbant Kimwipes tordu pour absorber la solution excédentaire autour de celle-ci. Ajoutez directement sur la rétine deux à trois gouttes supplémentaires d'agar et placez rapidement un cylindre en plastique pour former une paroi autour de la rétine, tout en maintenant celle-ci près du centre du cylindre ; ajoutez goutte à goutte de l'agar fondu supplémentaire, puis transférez la boîte de Pétri dans un bain d'eau glacée pour refroidir. Après 30 secondes, retirez le tissu et utilisez un piston pour extraire le bloc d'agar en poussant depuis le côté le plus éloigné de la rétine.

Utilisez une lame de rasoir à un seul tranchant pour découper un petit bloc d'agar contenant la rétine, puis fixez-le avec de la colle cyanoacrylate contre le butoir en agar sur le disque d'échantillon. Transférez le disque d'échantillon sur le porte-objet du microtome vibrant et versez de l'AIMS glacé en abondance dans le réservoir, en veillant à ce que le bloc contenant la rétine soit complètement immergé. Découpez des tranches rétiniennes d'une épaisseur d'environ 200 microns en utilisant la fréquence maximale de vibration de la lame et une vitesse d'avancement réglée de manière à ce qu'il faille entre quatre et cinq secondes pour traverser entièrement la rétine.

Utilisez une lame de scalpel numéro 11 pour découper chaque tranche utilisable à partir du bloc, une par une. Placez les tranches contenant la rétine dans des chambres d'enregistrement et maintenez-les fermement. À l'aide d'ancres pour tranches, fixez les fils de nylon qui traversent l'ancrage.

Appuyez fermement sur l'agar autour de la rétine, en laissant la rétine dégagée. Pour les enregistrements. Transférez la chambre d'enregistrement sur la platine du microscope droit.

Fermez le rideau et allumez la source de lumière infrarouge pour visualiser la coupe sur une caméra sensible à l'infrarouge. Sous le microscope, identifiez une coupe rétinienne présentant des photorécepteurs intacts à l'angle de coupe approprié. Des dommages superficiels peuvent être apparents en raison du processus de découpe.

À l’aide d’une pipette dont la pointe est cassée, aspirez délicatement les corps cellulaires morts. Pour éliminer cette fine couche de cellules, une fois qu’une couche saine de cellules vivantes est visible, identifiez un corps cellulaire situé dans la strate d’intérêt. Déplacez la pointe de la pipette de manière à créer une légère déformation de la membrane cellulaire, puis appliquez une pression négative ou entrante douce afin d’obtenir un scellement à haute résistance. Le mode « cellule entière » peut être obtenu en appliquant une pression négative à l’électrode pour pénétrer l’intérieur de la cellule.

Ensuite, stimulez le tissu rétinien avec de la lumière à l'aide de DEL afin d'évoquer des réponses. À la fin de l'enregistrement, capturez une image en utilisant la lumière d'excitation appropriée pour le fluorophore qui a diffusé dans la cellule à partir de la solution interne de la pipette. Ici, les potentiels évoqués par la lumière d'un neurone rétinien adapté à l'obscurité, en réponse à des éclairs lumineux d'intensité croissante, sont illustrés.

Cette figure est une image de fluorescence prise sur une coupe rétinienne où les cellules ont été remplies avec le fluorochrome Lucifer yellow ; la fluorescence induite montre la morphologie des cellules à partir desquelles des enregistrements en mode patch ont été réalisés. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une meilleure compréhension de certaines des complexités liées à l'obtention d'enregistrements en électrode à patch sur des tranches rétiniennes adaptées à l'obscurité. L'objectif de cette procédure est de mesurer les réponses induites par la lumière dans des conditions d'illumination contrôlées.

Pour ce faire, nous devons d'abord isoler la rétine, l'incorporer dans de l'agar et préparer ensuite des tranches rétiniennes à partir desquelles nous pouvons effectuer des enregistrements unitaires.