La transfection seule cellule dans des embryons de poulet

L'objectif général de cette procédure est d'injecter des plasmides codant pour la protéine fluorescente verte dans des cellules uniques provenant de somites de poulet ou de tubes neuronaux. Cette étape est réalisée en premier lieu en tirant des pipettes de microinjection possédant un diamètre d'ouverture de pointe approprié. La deuxième étape de la procédure consiste à préparer un stock de plasmide destiné aux injections.

La troisième étape de la procédure consiste à préparer les embryons pour l'injection. La quatrième étape de la procédure consiste à charger les micropipettes avec de l'ADN plasmidique. La dernière étape de la procédure consiste à injecter les tissus souhaités.

En fin de compte, on peut obtenir des résultats montrant l'éventail des dérivés en termes de nombre de cellules produites par des progéniteurs uniques marqués dans des sous-domaines choisis du somite et du tube neural grâce à la microscopie immunofluorescente. Bonjour, je suis Rael du laboratoire du professeur Heim, du Département de neurobiologie médicale de l'Université hébraïque de Jérusalem. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure d'injection de cellules uniques dans les somites et les tubes neuraux de poulet.

Nous utilisons cette procédure en laboratoire pour étudier la ségrégation des lignées de cellules somitiques et de cellules du tube neural. Commençons donc. Pour générer des cellules transfectées uniques dans des embryons de poulet, commencez par tirer des micropipettes. Nous tirons nos pipettes sur un tireur de pipettes standard Naga PP 83 avec un réglage de chaleur de 13,5.

Le réglage précis doit être calibré pour obtenir un diamètre de pointe de pipette compris entre huit et dix micromètres. Nous utilisons des filaments contenant des tubes en verre borosilicaté de un millimètre de diamètre extérieur et de 0,75 à 0,78 millimètres de diamètre intérieur. Vous pouvez également utiliser des micropipettes commerciales, sans filament, de un millimètre de diamètre extérieur et de 0,75 millimètre de diamètre intérieur.

Les pipettes préparées sont conservées dans une boîte en plastique, leurs embouts étant protégés du contact avec le bord de la boîte. Pour préparer l'ADN en vue d'une microinjection, le plasmide d'intérêt est transfecté dans des bactéries E. coli DH5α. Le jour suivant, selon des procédures standard, le plasmide est purifié à l'aide d'un kit de type Maxi prep. Pour les injections non clonales, on utilise une concentration d'ADN de 1 microgramme par microlitre.

Pour les expériences où des clones individuels sont souhaités, la concentration en plasmide sera beaucoup plus faible et devra être ajustée. Pour le P-C-A-G-G-F-P-A, une concentration de 0,05 à 0,1 microgramme par microlitre donne de bons résultats. Une fois la concentration optimale déterminée, nous recommandons de diluer l'ensemble du stock de plasmide purifié plutôt que des préparations individuelles à une concentration prédéterminée.

Cette dernière méthode pourrait introduire une certaine variabilité dans les taux de réussite, probablement en raison de variations de pureté et d'autres paramètres, tels que la proportion de plasmide en forme de superhélice. Pour préparer les œufs destinés à l'injection microscopique, les œufs de poule incubés en position horizontale selon leur axe longitudinal jusqu'au stade de développement souhaité sont tamponnés avec de l'éthanol à 70 % et laissés sécher. Ensuite, percer l'extrémité pointue de l'œuf à l'aide de ciseaux chirurgicaux. À l’aide d’une seringue de 10 millilitres et d’une aiguille de calibre 19, prélever deux millilitres d’albumine à partir de l’œuf, puis sceller les orifices avec du paraffine chauffée avant l’injection.

Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour ouvrir une fenêtre en haut de la coquille d'œuf afin d'empêcher les débris de pénétrer par l'ouverture. Placez un morceau de ruban adhésif sur la fenêtre et découpez un trou à travers celui-ci. Pour faciliter la visualisation de l'embryon, utilisez une capillaire étirée au feu montée sur un aspirateur pour injecter une encre non toxique, comme la pelican 17, sous l'épiderme blastique.

Ensuite, accédez à l'embryon en coupant et en écartant les membranes vitelline et/ou amniotique à l'aide d'épingles d'insecte de 0,14 millimètre montées sur un porte-aiguille afin de charger l'ADN dans la pipette tirée Eloqua, puis ajoutez une petite quantité de poudre de vert rapide à l'aide du capillaire. Aspirez une quantité minimale de plasmide à l'aide d'un capillaire de diamètre adéquat fixé à un aspirateur. Insérez-le ensuite à l'extrémité de la pipette opposée à la pointe aiguisée et chargez l'ADN aussi près que possible de l'extrémité aiguisée.

Ensuite, fixez la pipette à un injecteur manuel à pression d'air monté sur un micromanipulateur. Appliquez une pression minimale si nécessaire pour permettre à la solution de plasmide d'atteindre l'extrémité de la pipette. Introduisez la pipette dans le milieu liquide de l'œuf tout en appliquant une légère pression d'air afin d'éviter l'obstruction de son embout.

Une fois que le domaine tissulaire pertinent est perforé, la variation de pression suffit souvent à libérer le plasmide accompagné du vert rapide visible. Si cela ne se produit pas, appliquez une légère pression sur la seringue jusqu’à ce que le mélange de plasmide et de vert rapide soit éjecté. Répétez cette procédure le long de l’axe de l’embryon ; du PBS d’injection peut être ajouté.

Enfin, scellez la fenêtre avec du ruban adhésif et remettez les œufs dans l'incubateur. Évitez la ventilation et placez des petits récipients d'eau dans l'incubateur pour aider à maintenir l'humidité et augmenter les rendements. Si le site cible de l'injection était suffisamment superficiel pour être facilement visible, comme dans les somites dorsaux, le tube neural ou l'ectoderme, on peut mesurer le taux de réussite de l'expérience en effectuant une observation sur montage entier à l'aide d'un stéréomicroscope fluorescent.

Cette étape est particulièrement utile pour évaluer si un nombre excessif ou insuffisant de cellules a été marqué. Si une incubation supplémentaire est souhaitée, ajouter une solution de PBS contenant des antibiotiques à l’œuf après l’observation et remplacer le ruban adhésif du couvercle. En outre, on peut évaluer le taux de réussite de l’injection en réalisant des coupes sérielles des embryons et en effectuant une immunohistochimie.

Après quatre heures ou plus, les embryons sont fixés et préparés pour l'inclusion en paraffine. Les coupes montées sur lame de verre sont ensuite déparaffinées et immunomarquées ; des méthodes d'amplification pour la visualisation du marqueur, telles que la détection biotine-streptavidine, peuvent être souhaitables. Enfin, les coupes sérielles sont analysées afin de détecter les cellules marquées dans les segments injectés.

Si lors des essais initiaux on obtient plusieurs cellules au lieu d'une seule, la solution du plasmide doit être diluée et le processus répété jusqu'à l'obtention de résultats satisfaisants. Nous réalisons généralement une seule injection de P-C-A-G-G-F-P par acarien, en ciblant six à douze segments par embryon. Dans ces conditions, un signal net peut être détecté par observation sur montage entier, huit heures après l'injection, dans au moins un segment d'un embryon sur dix.

Dans cet exemple, un blastomère a été injecté avec un plasmide codant pour la GFP, et cinq heures plus tard, une seule cellule fluorescente est observée dans une vue en montage complet de l'embryon montrée ici. Lorsqu'on observe 24 heures après l'injection dans le blastomère central, un clone de cellules fluorescentes est visible dans un embryon monté en entier deux jours après l'injection clonale. L'analyse en coupes de ce segment révèle la présence de descendants clonaux dans le derme et le muscle, démontrant ainsi que des progéniteurs uniques génèrent les deux types de dérivés.

Concernant les somites, des progéniteurs épithéliaux neurogènes uniques dans le tube neural dorsal peuvent également être empalés, comme illustré dans cette coupe transversale, photographiée cinq heures après l'injection ici. Une analyse en coupes sériées a révélé que des transfections clonales étaient obtenues lorsque le taux de réussite était d'environ 10 %. Cela signifie que, par définition, la technique est très inefficace pour obtenir la clonalité. En revanche, dans ces conditions, plus de 93 % des événements d'étiquetage positifs se sont avérés être clonaux.

Nous venons de vous montrer comment injecter des cellules uniques d'embryons de poulet lors de cette procédure. Il est important de se souvenir de diluer une grande quantité de plasmide stock à une concentration idéale pour les infections de cellules uniques, puis d'utiliser cette dilution tout au long de vos expériences. Voilà, c'est terminé.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.