Expression, Solubilisation détergent, et purification d'un transporteur membranaire, la protéine MexB multirésistance

Afin de purifier la protéine membranaire Mex B, celle-ci est d'abord exprimée dans E. coli à l'aide de méthodes d'ADN recombinant. Ensuite, les membranes sont isolées et les protéines membranaires sont solubilisées à l'aide d'un détergent doux. La protéine membranaire solubilisée est purifiée par chromatographie d'affinité métallique immobilisée (iMac), puis la protéine est davantage purifiée par chromatographie de filtration sur gel.

Le degré de purification de la protéine est déterminé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS. Bien que cette procédure permette d'obtenir des informations sur les transporteurs transmembranaires responsables de la multirésistance aux médicaments, elle peut également être appliquée à d'autres protéines membranaires. La démonstration des procédures aujourd'hui sera effectuée par un étudiant diplômé de mon laboratoire. Pour cette procédure, MexB de Pseudomonas aeruginosa sera sous-cloné dans le vecteur d'expression pET-30b(+) de manière à ce que MexB soit exprimé avec une étiquette hexahistidine en position C-terminale. Commencer le soir en inoculant quatre cultures de 3 ml de milieu LB contenant de la kanamycine avec des transformants frais ou en utilisant un stock congelé, puis faire croître les cultures sur un rouleau à 37 °C pendant la nuit. Le matin.

Utilisez les cultures de nuit pour ensemencer 150 millilitres de LB contenant 30 microgrammes par millilitre. Le Mycin peut-il faire croître la culture à 37 degrés Celsius sur un agitateur l'après-midi ? Utilisez la petite culture pour ensemencer six fois un litre, deux milieux XYT contenant 30 microgrammes par millilitre.

De la canamycine dans des flacons à dos plat ? Utilisez 25 millilitres par culture pour une dilution de un à 40. Faites croître les cultures à 37 degrés Celsius jusqu'à ce qu'elles atteignent une densité optique.

600 de 0,4 à 0,6, environ 1,5 heure. Lorsque les cultures atteignent la densité appropriée, induire l'expression des protéines en ajoutant 0,5 millilitre d'IPTG à une concentration d'un molaire. Remettre tous les flacons dans l'agitateurs et continuer la culture à 30 degrés Celsius pendant la nuit, jusqu'à la récolte des bactéries le lendemain matin.

Récupérez les cultures à partir de l'agitateuse et refroidissez-les. Ensuite, pour récolter les cellules, transférez les cultures dans des tubes de centrifugation et centrifugez-les à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes à 5 000 tours par minute dans une centrifugeuse de grande capacité, pendant que les cellules sont en cours de centrifugation. Complétez 100 millilitres de tampon de resuspension cellulaire avec des inhibiteurs de DNAs protéase et de la lysozyme.

Ajoutez également des inhibiteurs de protéases à deux aliquotes de tampon de resuspension des membranes, comme indiqué dans ce tableau. Conservez les trois solutions sur de la glace une fois la centrifugation terminée. Resuspendez les culots cellulaires dans 100 millilitres de tampon de resuspension des cellules.

Ensuite, extrayez les cellules. La suspension cellulaire est chargée dans la cellule de pression française et la cellule est placée dans le presseur français. La pression est appliquée jusqu'à ce qu'elle atteigne 12 000 livres par pouce carré.

La vanne est ouverte très légèrement afin que les cellules brisées s'écoulent goutte à goutte. Il est important de ne pas ouvrir la vanne trop grand, car les cellules seraient expulsées brusquement avec trop peu de pression et ne seraient pas efficacement lysées. Recueillir le lysat cellulaire dans un flacon maintenu au frais sur de la glace.

Faites passer la solution cellulaire à travers une cellule de pression française à nouveau, à 12 000 livres par pouce carré. Transférez le lysat cellulaire dans des tubes de centrifugation en acier inoxydable 34 et centrifugez afin d'éliminer les débris cellulaires à 10 000 tours par minute pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius dans un rotor SS 34. Le lysat clarifié est ensuite obtenu.

Utilisé pour préparer la fraction membranaire. Transférez soigneusement le surnageant dans des tubes d'ultracentrifugation ti. 6 4, 7 0.5, puis centrifugez dans un rotor TI 6 4 7 0.5 à 40 000 tours par minute pendant 50 minutes à quatre degrés Celsius.

Jetez le surnageant. Utilisez une pipette pour resuspendre délicatement le culot, qui contient les membranes cellulaires, dans environ 25 millilitres de tampon de resuspension des membranes. Transférez la suspension de membranes dans un tube de centrifugeuse propre et centrifugez à 40 000 tours par minute pendant 50 minutes à 4 degrés Celsius dans un rotor TI I 6 4 7 0.5, puis resuspendez le culot de membranes lavées dans 25 millilitres de tampon de resuspension des membranes. Ensuite, solubilisez les protéines membranaires dans les membranes resuspendues d’environ 25 millilitres.

Ajoutez six millilitres de DDM à 10 % afin d'obtenir une concentration finale en détergent de 2 % ; agitez doucement une heure à quatre degrés Celsius. Après une incubation de deux heures en présence de DDM, centrifugez le mélange à 40 000 tours par minute pendant 40 minutes à quatre degrés Celsius dans le rotor TI I 6 4 7 0.5, afin de séparer les complexes protéine-détergent solubles des protéines insolubles. Conservez le surnageant contenant les complexes protéine Mex B-détergent pour l'utiliser lors de la purification. Mélangez le surnageant contenant les complexes protéine Mex B-détergent avec deux millilitres de billes d'affinité métallique chargées en ions, équilibrées dans le tampon de resuspension Resus, puis incubez une heure sur un rouleau à quatre degrés Celsius après la liaison des protéines à la résine.

Verser la suspension dans le corps d'une colonne à écoulement par gravité et éliminer l'écoulement initial. Laver la colonne avec 20 millilitres ou 10 volumes de colonne de tampon de liaison et de lavage iMac ; une fois le lavage de la colonne terminé. Éluer les protéines liées à l'aide de 10 millilitres de tampon d'élution iMac.

Prélevez des échantillons de 10 microlitres de chaque fraction d'élution. Mélangez avec 10 microlitres de tampon d'échantillonnage SDS deux fois concentré et analysez sur un gel de polyacrylamide 10 % SDS.

Estimez la quantité et la pureté de Mex B dans chaque fraction. Récupérez les fractions contenant les complexes détergent-protéine de Mex B et concentrez-les à l’aide d’un concentrateur à centrifugation à quatre degrés Celsius. Veillez à ce que la protéine ne précipite pas à cette étape.

Effectuez plusieurs centrifugations courtes et surveillez la précipitation. Après chaque centrifugation, passez à la purification des fractions regroupées à l’aide d’une colonne de filtration sur gel. Équilibrez préalablement une colonne Super Rose 12 HL 30/10 avec 24 millilitres de tampon de migration et attendez d’obtenir une ligne de base stable.

Ensuite, rincez la boucle de chargement du système à colonne avec le tampon de migration. Avant d'appliquer la protéine sur la colonne, filtrez la solution protéique à l'aide d'un filtre à seringue. Puis chargez jusqu'à 240 microlitres de la solution protéique sur la colonne, contenant une protéine à une concentration allant jusqu'à cinq milligrammes par millilitre.

Éluer avec 1,5 volume de colonne de tampon et recueillir des fractions de 0,25 millilitre. Les complexes protéiques au détergent XB sortent en un pic aux environs de 10 à 15 millilitres de volume d'élution. Prélever des échantillons de cinq microlitres des fractions correspondant au pic.

Mélangez chaque échantillon un à un avec un tampon d'échantillonnage SDS deux fois concentré. Analysez les échantillons sur un gel de polyacrylamide à 10 % afin d'estimer la quantité et la pureté de me Mex B dans chaque fraction, puis réunissez les fractions contenant ME B pur. Ce gel de polyacrylamide a été chargé avec les fractions récupérées à partir de la colonne iMac et des fractions individuelles provenant de la colonne de filtration sur gel. Après la colonne de filtration sur gel, la protéine apparaît pure sur le gel de polyacrylamide coloré au kumasi.

Un tracé de la colonne de filtration sur gel montre le pic principal du complexe protéine-détergent élué de la colonne. Le rendement moyen de la protéine mxb est d'environ deux milligrammes par six litres de culture 2XYT. Une fois maîtrisée, cette procédure peut être réalisée en huit heures si elle est effectuée correctement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'exprimer, de solubiliser et de purifier une protéine membranaire.