Visualisation de la réplication d'ADN mitochondrial dans des cellules individuelles par amplification du signal EdU

L'objectif général de cette procédure est de marquer et de visualiser la réplication de l'ADN mitochondrial dans des neurones en culture. Cela est réalisé en incubant d'abord les neurones avec l'analogue de la thymidine EDU pendant deux à 24 heures. La deuxième étape de la procédure consiste à marquer l'EDU contenant un alcyne avec l'azoture de fluorophore Orgon vert 488 au moyen d'une réaction covalente catalysée par le cuivre.

La dernière étape de la procédure consiste à amplifier le signal orgon vert à l'aide d'une étape d'amplification du signal à base d'aramide afin de visualiser l'EDU incorporé dans l'ADN mitochondrial nouvellement synthétisé. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent la réplication de l'ADN mitochondrial dans des compartiments sous-cellulaires spécifiques des neurones, grâce à la combinaison de la chimie de clicka EDU et d'une amplification subséquente du signal de type tear mind. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme le marquage par BRDU est que le marquage par EDU est plus simple et plus doux, permettant ainsi une coloration immunofluorescente supplémentaire de marqueurs neuronaux.

Cette méthode peut répondre à des questions fondamentales concernant la régulation du nombre de mitochondries, notamment la manière dont les neurones s'adaptent aux besoins énergétiques variables de leurs compartiments subcellulaires, tels que les corps cellulaires, les axones, les dendrites et les terminaisons synaptiques. Ainsi, cette méthode permet d'élucider les mécanismes impliqués dans la pathogenèse de nombreuses maladies neurologiques liées aux mitochondries, telles que les neuropathies et la neurodégénérescence. Mais surtout, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes dans lesquels des modifications du nombre de copies d'ADN mitochondrial pourraient sous-tendre la pathogenèse de l'état pathologique, notamment la toxicité médicamenteuse, le cancer et le vieillissement.

Ce vidéo montrera comment marquer l'ADN mitochondrial nouvellement synthétisé, abrégé en M-T-D-N-A, dans des neurones du ganglion de la racine dorsale cultivés sur des lamelles de verre stériles de 12 millimètres. Dans une plaque de culture à 24 puits, diluez le stock de 10 millimolaire de cinq-éthynyl-2'-désoxyuridine, abrégé en EDU provenant du kit d'essai Clicka EDO Microplate, d'un facteur de 1 à 100 dans le milieu de culture afin d'obtenir un stock de 10 XEDU. Le stock de 10 XEDU est ensuite ajouté directement dans le milieu de chaque puits. Incubez les neurones traités pendant deux à 24 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans une hotte.

Fixer les neurones dans du paraformaldéhyde à 2 % pendant 10 à 15 minutes à température ambiante. Rincer deux fois dans du PBS 1X pendant deux à cinq minutes par rinçage. Les neurones fixés peuvent être conservés dans du PBS 1X frais à quatre degrés Celsius pendant jusqu'à un mois.

Préparez une chambre humide comme décrit dans le texte accompagnant. Utilisez une pince fine pour transférer 28 lamelles fixées, incluant des contrôles positifs et négatifs d'EDU, sur des feuilles de paraforme hydrophobe M à l'intérieur de la chambre humide. Réappliquez 200 à 300 microlitres d'un XPBS pour recouvrir la surface de chaque lamelle.

Préparez le kit d'analyse Click it comme décrit dans le texte et conformément aux instructions du fabricant afin de marquer l'ADN mitochondrial à l'aide de 75 à 80 microlitres d'une solution perméabilisante contenant 0,1 % de Triton X dans du PBS 1X pour chaque lamelle. Incubez à température ambiante pendant 10 minutes. Utilisez une pipette à pompe avec une pointe de 200 microlitres fixée à l'extrémité pour retirer délicatement le liquide sans perdre les cellules.

Utilisez une pipette en caoutchouc pour inonder doucement la lamelle. Rincez avec 200 à 300 microlitres d'une XPBS afin d'éliminer complètement la solution précédente. Lavez chaque lamelle deux fois.

Prélèver 75 à 80 microlitres de peroxyde d'hydrogène frais à 1 % dans un XPBS sur chaque lame. Incuber, recouvert, pendant 30 minutes à température ambiante afin d'inhiber l'activité peroxydasique endogène. Rincer deux fois avec un XPBS comme précédemment, puis préparer fraîchement le mélange de réaction « click » comme indiqué dans le texte accompagnant.

Pipetez de haut en bas pour mélanger. Ne pas vortexer après la fixation des neurones avec 75 à 80 microlitres de fixateur click at EDU par lamelette, puis incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Pendant l'incubation post-fixation, diluez le mélange réactionnel avec un volume égal de fixateur clicka EDU.

Ajoutez le cocktail de réaction sur chaque lame afin de la protéger de la lumière et incubez-la à température ambiante pendant 25 minutes. Éliminez délicatement le cocktail de réaction et rincez deux fois avec un tampon de blocage dilué à 1 x sous un microscope à fluorescence épiscopique. Vérifiez la coloration verte des organites dans les noyaux lorsque la coloration EDU est terminée.

Commencez l'amplification du signal par TSA en ajoutant une solution de blocage TSA à 1 % sur chaque lame et incubez à température ambiante pendant 30 minutes. Faites brièvement tourner par centrifugation le stock d'anticorps conjugué à la peroxydase de raifort vert antioïdien préparé entre deux et 24 heures avant la dilution TSA ; diluez l'anticorps primaire au 1/300 dans la solution de blocage TSA et mélangez en retournant ou en pipetant sans vortexer. Ajoutez 75 microlitres sur chaque lame, puis incubez à quatre degrés Celsius toute la nuit.

Le lendemain, rincer trois fois avec un XPBS à température ambiante. Incuber les lamelles dans le lavage final pendant 30 à 60 minutes supplémentaires afin de garantir l'élimination de l'anticorps primaire non lié. Préparer la réaction IDE conformément à la partie textuelle de ce protocole juste avant utilisation.

Incuber les lamelles avec la réaction IDE pendant 15 minutes à température ambiante. Rincer trois fois avec un XPBS, en effectuant une incubation lors du dernier rinçage de 30 à 60 minutes comme précédemment, sous microscope. Vérifier l'étiquetage de l'ADN mitochondrial ; monter les neurones correctement colorés sur des lames en verre avec un milieu de montage ANTIFA contenant du DPI. Les images représentatives présentées ici, obtenues en contraste interférentiel différentiel, correspondent à des neurones du ganglion de la racine dorsale embryonnaires et adultes, couramment utilisés pour l'analyse.

Ces schémas représentent la procédure de marquage de l'EDU dans l'ADN mitochondrial à l'aide d'un signal fluorescent vert. Les cellules de neuroblastome F11 en activité mitotique servent de contrôle positif et illustrent le profil de marquage de l'EDU incorporé dans l'ADN nucléaire et mitochondrial, comme le montrent ces images représentatives de fluorescence superposées à un champ clair. Les signaux ponctuels verts montrent le signal amplifié d'EDU incorporé dans le nouvel ADNmt synthétisé par les neurones des ganglions de la racine dorsale embryonnaires et adultes.

La procédure de marquage par l'EDU permet une coloration immunofluorescente ultérieure de marqueurs neuronaux tels que le neurofilament en rouge. Ces schémas représentent la procédure de marquage de l'EDU et de l'ADN mitochondrial à l'aide d'un signal fluorescent rouge. Les cellules de neuroblastome F11 présentant une activité mitotique servent de contrôle positif et illustrent le profil de marquage de l'EDU incorporé dans l'ADN nucléaire et mitochondrial.

Ce schéma représente la procédure d'étiquetage de la BRDU dans l'ADN mitochondrial nouvellement synthétisé à l'aide d'un signal fluorescent vert ou rouge. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de toujours inclure des contrôles utilisant des cellules mitotiquement actives afin de vérifier l'étiquetage réussi de l'EDU et des noyaux cellulaires avant de passer aux étapes d'amplification permettant de visualiser l'étiquetage de l'ADN mitochondrial. Après cette procédure, d'autres méthodes comme l'immunofluorescence classique peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que la régulation de la synthèse de l'ADN mitochondrial dans des sous-populations spécifiques de neurones ou des compartiments neuronaux. En raison de son développement, cette technique ouvrira la voie aux chercheurs en neurobiologie pour explorer la régulation du nombre de mitochondries dans des modèles cellulaires de physiologie normale ainsi que dans des modèles cellulaires simulant des pathologies altérées.

États neurologiques.