Préparation de la souris Immunogène hypophysaires pour l'induction de hypophysite auto-immune expérimentale

L'hypophysite auto-immune se caractérise par un agrandissement de l'hypophyse et une carence en une ou plusieurs hormones hypophysaires. Les auto-antigènes responsables restent inconnus. Nous démontrons ici un protocole permettant la préparation de protéines d'hypophyse de souris en vue de l'étude de cette maladie.

Les premières glandes pituitaires sont isolées à partir de souris euthanasiées. Les pituitaires sont ensuite homogénéisées afin de briser mécaniquement les cellules et libérer les protéines cytosoliques. L'homogénat est clarifié par une centrifugation à faible vitesse et évalué quantitativement par un dosage colorimétrique, le test BCA, et qualitativement par électrophorèse sur gel de polyacrylamide.

Enfin, l'homogénat protéique aqueux est mélangé à un adjuvant huileux. Ce mélange est ensuite injecté chez des souris pour créer un modèle murin simulant une hypophysite auto-immune. Comme le montre la vidéo associée, quatre techniques ont été décrites pour induire une hypophysite chez des animaux expérimentaux.

La technique présentée dans cet article, qui consiste à injecter un mélange de protéines hypophysaires avec un adjuvant grippal, est la plus ancienne, remontant aux années 1960. D'autres approches ont inclus l'injection de glycoprotéines solubles du virus de la rubéole en 1992, l'injection stéréotaxique d'un adénovirus directement dans la glande pituitaire en 2002, et la transplantation de glande pituitaire d'une souche de rat sous la capsule rénale d'une autre souche de rat en 2010. Le principal avantage de l'approche utilisant l'adjuvant de Florence est qu'elle est aujourd'hui moins invasive, plus reproductible et surtout plus précise pour induire une maladie qui ressemble étroitement à sa forme humaine.

Bien qu'ayant été décrite dès les années 1960, la technique de l'adjuvant étranger s'est révélée peu efficace pour induire une hypophysite. Lorsque j'ai commencé mes travaux de thèse, je ne pouvais obtenir qu'une incidence et une sévérité modérées d'hypophysite en utilisant le protocole d'adjuvant étranger publié. Les choses se sont nettement améliorées lorsque j'ai eu l'idée d'augmenter d'un facteur dix la quantité de protéines pituitaires contenues dans l'émulsion EM.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la pathogenèse de l'hypophysite auto-immune, elle peut également être utilisée pour étudier d'autres maladies auto-immunes dont les auto-antigènes restent à identifier. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent principalement des difficultés avec la dernière étape, la préparation de l'émulsion, car elle exige des compétences manuelles, du temps et de la persévérance. Une démonstration visuelle est donc essentielle pour comprendre comment préparer correctement une émulsion.

Les implications de cette technique vont au-delà du domaine de l'auto-immunité. Savoir comment préparer l'antigène in vivo pour l'immunisation peut également être utilisé dans la production d'anticorps monoclonaux ou pour tester de nouveaux vaccins. Cette technique sera démontrée par S Zoo héroïque Ura et Mayland al gato de mon laboratoire.

La glande pituitaire de la souris est une glande de forme cylindrique située à la base du crâne, dans une dépression de l'os sphénoïde appelée fossa hypophysaire. Latéralement, la glande est délimitée par les nerfs trijumeaux et, en avant, par la chiasma des nerfs optiques. Elle est composée d'un lobe antérieur plus volumineux ainsi que de lobes intermédiaire et postérieur plus petits.

Pour isoler la glande pituitaire, utilisez des ciseaux pour décapiter la souris euthanasiée, puis effectuez des incisions parallèles de l'arrière vers l'avant du crâne. Soulevez le cerveau et retournez-le vers l'arrière afin d'exposer la glande pituitaire, qui apparaît sous la forme d'un cylindre situé dans le contexte d'un triangle isocèle. La glande pituitaire en constitue la base, les nerfs trijumeaux les côtés, et la chiasma optique le sommet.

Faites le tour de la glande avec les extrémités de la pince fermée afin de rompre les méninges environnantes. Ensuite, à l’aide d’une pince fine, saisissez l’hypophyse de la fosse hypophysaire et placez-la dans un tube en plastique sur de la glace sèche. Pour une préparation, collectez 300 glandes hypophysaires de souris.

Cette collecte nécessite environ neuf heures de travail. Une fois la collecte terminée, conserver les glandes pituitaires à moins 80 degrés Celsius jusqu'à ce qu'elles soient nécessaires. Placer un tube Falcon de 15 millilitres dans un bain de glace.

Ajoutez dans le tube 250 microlitres de tampon d'homogénéisation. Pour chaque 100 hypophyses collectées juste avant l'homogénéisation, ajoutez les glandes hypophysaires de souris dans le tampon. Ensuite, placez la sonde de l'homogénéisateur Polytron équipée d'un générateur de cinq millimètres de diamètre au fond du tube Falcon contenant les hypophyses de souris et le tampon, puis homogénéisez à vitesse maximale pendant 30 secondes.

Déplacer doucement le tube de haut en bas tout en le maintenant sur de la glace. Laisser ensuite l'homogénat au repos sur la glace pendant une minute. Répéter les étapes d'homogénéisation et de refroidissement deux fois supplémentaires.

Cette homogénéisation douce doit rompre les cellules et libérer les protéines sans endommager les noyaux. Centrifuger l'homogénat à basse vitesse, environ 1000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, afin de faire sédimenter les noyaux, les tissus non rompus et les matériaux insolubles tels que les tissus conjonctifs et les complexes de protéines dénaturées. Veiller à ne pas perturber le culot.

Transférez le SNA, désormais appelé surnageant post-nucléaire ou PNS, dans un nouveau tube Falcon. Conservez le PNS sur glace, reprenez le culot en utilisant le même volume de tampon d'homogénéisation qu'auparavant, homogénéisez et centrifugez comme précédemment. Après avoir regroupé les deux échantillons de PNS, répartissez la solution dans de nombreux tubes de microcentrifugeuse.

Conserver les tubes de microcentrifugeuse à moins 80 degrés Celsius jusqu'à ce qu'ils soient nécessaires. Cette préparation protéique est stable à moins 80 degrés Celsius, mais perd progressivement son efficacité. Il est donc recommandé de l'utiliser dans les six mois suivant sa préparation.

Conserver un petite aliquote de SNS afin de déterminer le rendement et la concentration en protéines par l'analyse à l'acide biy. Ensuite, évaluer la qualité des protéines par électrophorèse sur gel à partir de 300 glandes pituitaires de souris, dont le poids total moyen est d'environ 570 milligrammes. Prévoir un rendement de 60 milligrammes de protéines pituitaires, soit un milligramme de protéine pour chaque 10 milligrammes de tissu.

La concentration en protéines est généralement d'environ 40 milligrammes par millilitre. L'exemple fourni ici concerne l'immunisation de 10 souris. Prévoyez d'injecter à chaque souris 100 microlitres d'émulsion contenant un milligramme de protéine hypophysaire ; afin de tenir compte des pertes de matériel lors de la préparation, préparez ici 12 milligrammes d'émulsion protéique pour deux souris supplémentaires.

Commencez par décongeler rapidement les aliquotes de protéines congelées en les réchauffant dans vos mains. Ajustez la concentration en protéines à 20 milligrammes par millilitre à l'aide de PBS. Ensuite, aspirez 600 microlitres d'extrait protéique hypophysaire correspondant à 12 milligrammes dans une seringue Hamilton Gas Tite de 2,5 millilitres et resuspendez l'adjuvant complet de Freund ou CFA contenant cinq milligrammes par millilitre de mycobactéries tuberculeuses tuées par la chaleur en agitant manuellement.

Ensuite, prélevez 600 microlitres de CFA dans une autre seringue Hamilton de 2,5 millilitres. Fixez et serrez une aiguille microémulsifiante de calibre 22 sur la seringue remplie de CFA. Poussez lentement le piston de manière à remplir l'aiguille de CFA.

Ensuite, fixez et sécurisez l'autre extrémité de l'aiguille à la seconde seringue remplie d'extrait protéique hypophysaire. Veillez à ne pas emprisonner de bulles d'air à l'intérieur des seringues. Faites avancer lentement le piston de la seringue contenant l'adjuvant de Freund complet (CFA) afin d'injecter la phase huileuse dans l'extrait hypophysaire aqueux, en mélangeant uniquement une petite quantité.

Ensuite, repousser le piston de la seringue contenant l'extrait hypophysaire dans la seringue contenant l'adjuvant de Freund complet (CFA). Répéter cette opération en augmentant progressivement la quantité de produit mélangé jusqu'à ce que l'ensemble du contenu soit homogénéisé. Ce mélange blanchâtre et uniformément réparti représente l'émulsion eau-huile.

Une fois l'émulsion formée, répétez le cycle complet aller-retour au moins 500 fois. Après le dernier cycle, les seringues contiendront une émulsion eau-huile en rapport un pour un, où la concentration en protéines hypophysaires est désormais de 10 milligrammes par millilitre. L'émulsion est prête à être utilisée pour tester sa qualité : déposez une goutte dans un bécher d'eau. Si l'émulsion est correctement préparée, la goutte restera compacte et bien définie à la surface.

Si l'émulsion est de mauvaise qualité, elle s'étale et se divise en gouttelettes plus petites. L'émulsion est injectée le jour même de sa préparation chez des souris SJL pour induire une hypophysite auto-immune expérimentale. Ce protocole est décrit en détail dans le joVE associé.

Une fois que la glande pituitaire a été collectée et que les techniques sont maîtrisées, on peut réaliser l'expression protéique en une heure, en veillant à travailler rapidement et sur glace. Pendant cette étape, lors de la préparation de l'immersion, qui nécessite environ une heure. N'oubliez pas de travailler lentement et patiemment lors de la phase initiale de mélange, après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'auto-immunité pour explorer les mécanismes par lesquels les lymphocytes autoréactifs reconnaissent et pénètrent dans l'organe cible. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation d'un extrait protéique à partir de la glande pituitaire de souris et de la manière de le mélanger avec des adjuvants de Freund complets afin de préparer une émulsion prête à être utilisée comme immunogène. N'oubliez pas que le travail avec des seringues et des adjuvants de Freund complets, qui contiennent une tuberculose microbactérienne inactivée et sèche, peut présenter des risques si vous vous piquez accidentellement.

Utilisez donc toujours des gants jetables et jetez les aiguilles correctement lors de l'exécution de cette procédure.