ELISA immunospot (ELISPOT): Quantification des Th-1 réponses immunitaires cellulaires contre des antigènes microbiens

L'objectif général de cette procédure est de détecter les réponses des lymphocytes T aux antigènes d'intérêt. Cela est réalisé en premier lieu par un codage à l'aide d'anticorps de capture. La deuxième étape de la procédure consiste à ajouter les cellules et les antigènes d'intérêt, puis à incuber toute la nuit.

La troisième étape de la procédure consiste à ajouter les anticorps de détection. La dernière étape de la procédure est le développement de la plaque à l'aide de réactifs substrat et l'analyse des taches. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus permettant de sélectionner les cytokines d'intérêt par l'analyse des unités formant des taches.

Bonjour, je m'appelle le Dr Ki Richter et je suis enseignant-chercheur dans le laboratoire du Dr Wonder Drake à l'Université Vanderbilt, au sein de la division des maladies infectieuses. Aujourd'hui, nous allons vous présenter la technique du spot ELISA, également connue sous le nom de test immunoenzymatique par détection de spots. Les Drs Isfahan Chambers et Tiffany Cone vont vous démontrer cette technique aujourd'hui.

Afin de maintenir les normes de culture cellulaire, effectuez les manipulations en conditions stériles dans la hotte, ouvrez une plaque à puits et rincez trois fois avec du PBS. Préparez une solution d'anticorps de capture dans du PBS. Mélangez soigneusement par vortex pour plus de commodité.

Transférez la solution d'anticorps dans un réservoir pour pipette multicanal et aliquotez 100 microlitres de solution de revêtement dans chaque puits. Scellez soigneusement la plaque avec du perfil et placez-la au réfrigérateur toute la nuit. Ces plaques revêtues d'anticorps sont stables pendant plusieurs semaines.

La règle empirique veut qu'une plaque puisse être utilisée s'il reste du liquide dans les puits. Pour préparer les cellules pour ce dosage, colorer les cellules mononucléées du sang périphérique fraîchement isolées au bleu de tripan pour évaluer la viabilité et compter les cellules. Sémer les PBMC à 2 millions de cellules par millilitre dans notre milieu 10 et incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Afin de suivre l'expérience, étiqueter le couvercle de la plaque ELISpot avec le numéro d'identification de l'échantillon, les conditions des puits et la date.

Lavez la plaque six fois avec du PBS stérile en utilisant la méthode de vidage et de tamponnage. Veillez à ne pas éclabousser la plaque lors du vidage, car cela pourrait provoquer un virage au violet des puits de la plaque. Ajoutez notre milieu 20 dans chaque puit et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Pendant l'incubation de la plaque, comptez les cellules qui ont été mises au repos pendant la nuit. Récupérez les PBMC par centrifugation. Jetez le surnageant et resuspendez le culot dans notre milieu 10 à une concentration d'un million de cellules par millilitre.

Après une heure d'incubation de la boîte avec les taches d'alliés, retirez le milieu R 20 selon la méthode de vidage et de tamponnage. Veillez à ne pas éclabousser la boîte lors du vidage. Ajoutez 100 microlitres de suspension cellulaire à chacun.

Suivez le plan expérimental en ajoutant les peptides et les antigènes aux puits de test correspondants. Incluez toujours un contrôle négatif avec des cellules sans peptides, ainsi que des puits témoins positifs avec la phytohémagglutinine ajoutée. Incubez la plaque toute la nuit à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.

Lavez la plaque six fois avec 150 microlitres de XPBS en utilisant la méthode de vidage et de tamponnement. Ajoutez 100 microlitres de PBS dans chaque puits de la plaque et placez la plaque au réfrigérateur ou à température ambiante pendant 15 minutes. Pendant ce temps, préparez la solution d'anticorps biotinylé dans du PBS.

Sortez la plaque à puits ALI du réfrigérateur et jetez le PBS en le faisant tomber dans la poubelle. Faites attention à ne pas éclabousser la plaque tout en déposant un aliquot de la solution d'anticorps biotinylé dans chaque puits, puis incubez la plaque dans la hotte de culture tissulaire à température ambiante pendant une heure. Lavez la plaque six fois avec du PBS en utilisant la méthode de vidage et de tamponnement lors du dernier lavage.

Laissez le PBS sur la plaque maintenant. Préparez la solution d'anticorps STREPTAVIDINE dans le PBS, en veillant à vortexer la solution pour bien la mélanger. Jetez le dernier lavage de PBS des puits et placez la plaque avec les points ALI.

Ajouter la solution d'anticorps streptavidine dans chaque puits et incuber la plaque dans la hotte de culture tissulaire à température ambiante pendant une heure. Afin d'éliminer l'excès d'anticorps trevain, laver la plaque six fois avec du PBS en utilisant la méthode de vidage et de séchage ; lors du dernier lavage, laisser le PBS sur la plaque. Étant donné la sensibilité à la lumière de la solution de substrat de phosphatase alcaline B-C-I-P-M-B-T.

Travaillez à l’obscurité lors de la préparation de la solution de substrat, comme indiqué par le fabricant dans les instructions du kit de substrat pour la phosphatase alcaline. Jetez le reste de la PBS contenue dans les puits et essuyez délicatement la plaque. Ajoutez la solution de substrat dans chaque puits, puis allumez la lumière. Après cinq à dix minutes de développement de la couleur, laissez les réactifs en place jusqu’à ce que les taches commencent à devenir violettes et soient bien foncées.

Cela prend jusqu'à 20 minutes. Lavez la plaque à puits Ali trois fois avec de l'eau du robinet et laissez sécher à l'air. Chaque plaque contient un témoin positif, un témoin négatif et le peptide d'intérêt, réalisés au minimum en double.

Les puits témoins positifs présentant une couleur violet foncé reflètent une couche confluente de cellules et presque aucun fond blanc. Les puits témoins négatifs ne présentent ni fond violet ni taches, comme attendu. Les puits des échantillons en test illustrent ici les réponses cellulaires aux peptides microbiens.

Les taches violettes représentent une cellule unique exprimant la cytokine d'intérêt lors de la réalisation de la technique LA spot. Veuillez faire attention à ne pas percer la membrane avec les embouts de votre pipette ni laisser votre plaque sécher, car cela entraînerait un fond élevé.