Dans la quantification in vivo des interactions des protéines G récepteurs couplés utilisant résolution spectrale microscopie à deux photons

L'objectif général de l'expérience suivante est de déterminer des informations stœchiométriques et structurales sur une protéine. Tous les complexes ligamentaires exprimant des cellules biologiques vivantes, les cellules de levure sont modifiées génétiquement pour exprimer les protéines d'intérêt liées à une sonde fluorescente donneur ou accepteur. Les sondes donneur peuvent être excitées directement par un laser.

Bien que les accepteurs ne puissent être excités que par un transfert d'énergie en provenance d'un donneur proche excité, les cellules sont exposées à une lumière provenant d'un laser pulsé proche infrarouge. La fluorescence émise par les sondes est séparée en ses composantes spectrales par un réseau de transmission et projetée sur la surface d'un réseau CCD à multiplication d'électrons. Ainsi, des spectres fluorescents complets provenant d'individus isolés, tous les ligaments, sont obtenus pour chaque position de l'échantillon.

Le profil spectral de la fluorescence détectée dépend de l'interaction spécifique des protéines d'intérêt. Les données sont analysées afin de déterminer, pour chaque pixel d'image d'une cellule scannée, les émissions séparées des sondes donneur et accepteur. L'efficacité du transfert d'énergie est déterminée pour chaque pixel d'image, puis les pixels sont regroupés selon leur efficacité FRET et leur histogramme.

L'interprétation de l'histogramme permet la détermination in vivo de la taille, de la configuration et de la protéine ou du complexe. Bonjour, je m'appelle Michael Stoneman du groupe de recherche Riku à l'Université du Wisconsin à Milwaukee. Je m'appelle Singh.

Je viens du laboratoire Rikus à Milwaukee, Wisconsin. Le principal avantage de cette technique est que les profils d'émission complets provenant de centaines de complexes ligamentaires entiers au sein d'une cellule sont obtenus grâce à un seul balayage complet de la cellule. Habituellement, la plupart des méthodes de microscopie de fluorescence nécessitent que la cellule d'intérêt soit balayée plusieurs fois afin d'accumuler suffisamment d'informations spectrales pour déterminer l'efficacité de transfert d'énergie par résonance (FRET) dans différentes régions d'intérêt au sein de la cellule.

Cependant, les réactions biochimiques de diffusion peuvent modifier la composition moléculaire de ces régions d'intérêt et ainsi limiter l'information obtenue lors de l'analyse de l'image. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans l'étude des protéines et des interactions protéiques dans les cellules vivantes, telles que quelle est la taille des oligomères nuisibles ? À quel stade du cycle de vie de la protéine les oligomères se forment-ils, et quel est le rôle des oligomères de cette protéine dans la fonction cellulaire ?

Le microscope à deux photons à résolution spectrale accumule des informations spectrales sur les complexes oligomères dans la cellule image en balayant le foyer du faisceau d'excitation à travers l'échantillon d'intérêt en plusieurs emplacements. Une paire de miroirs de balayage orthogonaux est utilisée pour déplacer le foyer du faisceau laser à travers l'échantillon dans deux directions différentes. Le mouvement des miroirs de balayage est contrôlé par ordinateur et synchronisé avec l'extraction des données d'intensité de fluorescence provenant de la caméra CCD ; à partir des cartes spatiales d'intensité de fluorescence en balayage linéaire, des cartes correspondant à une longueur d'onde particulière de la lumière peuvent être reconstruites.

Afin de reconstruire précisément les cartes spatiales d'intensité de fluorescence X et de calculer la longueur d'onde réelle correspondant à chacune de ces cartes, le protocole de balayage linéaire doit être calibré à l'aide d'une solution de fluorescéine. Pour commencer la procédure de calibration, envoyer vers le spectre d'excitation à une longueur d'onde de 800 nanomètres, ce qui correspond à deux fois la longueur d'onde d'excitation maximale du marqueur donneur GFP deux deux pour atteindre le spectre d'excitation, translater le prisme situé à l'intérieur de la cavité laser afin de modifier la dispersion de vitesse de groupe à l'aide du programme informatique auquel la caméra est reliée. Envoyer une commande à la puce CCD pour abaisser la température de la puce CCD à sa température minimale atteignable.

Afin de réduire le bruit de fond sombre, pipeter 10 microlitres de solution de fluorescéine sur une lame de microscope recouverte d'une lamelle de façon à ce qu'une couche mince de l'échantillon soit uniformément répartie dans la zone située entre la lamelle et la lame de microscope. Placer une petite goutte d'huile à immersion sur la surface de la lamelle. Fixer ensuite la lame de microscope sur la platine de translation XY, Z et déplacer la lame et la platine dans la direction de l'axe optique en ajustant manuellement l'actionneur linéaire, jusqu'à ce que l'objectif du microscope entre en contact avec la goutte d'huile à immersion. Passer la caméra en mode vidéo d'acquisition de données afin que la lumière détectée par le réseau CCD soit affichée en temps réel sur l'écran de l'ordinateur.

Éteignez toutes les lumières ambiantes de la pièce afin de réduire le bruit de fond détecté par le réseau CCD. Réglez lentement le micromètre contrôlant le déplacement de la platine dans la direction de l'axe optique pour amener l'échantillon au foyer du faisceau laser. Lorsque l'échantillon de fluorescéine est au point, l'émission apparaîtra sous forme d'une ligne nette sur le réseau CCD.

Téléchargez les données des intensités des pixels depuis le réseau CCD vers l'ordinateur. Mesurez l'intensité des pixels en fonction de la position sur le réseau CCD en ouvrant dans ImageJ la matrice des valeurs d'intensité téléchargée et en traçant une ligne à travers la région fluorescente. Utilisez la commande « image day ».

Analyser le profil du tracé pour créer un graphique illustrant le spectre d'émission de l'échantillon de fluorescéine. Ajuster le paramètre incrémentiel du miroir, qui contrôle le déplacement du laser. Focaliser dans la direction Y, de sorte que des positions Y adjacentes dans l'échantillon entraînent un déplacement du pic des spectres de fluorescence d'exactement un pixel le long de la dimension spectrale sur le réseau CCD.

Pour surveiller cela, téléchargez l'intensité des spectres de fluorescéine pour deux positions Y différentes dans l'échantillon. Ensuite, ouvrez les images d'intensité avec ImageJ et déterminez la position du pixel de pic pour chacun des spectres fluorescents. À l'aide du curseur d'ImageJ, laissez l'obturateur du CCD ouvert et balayez le foyer laser à travers l'échantillon dans la direction X.

La lumière émise par chaque voxel le long de la ligne de balayage doit atteindre l'alignement CCD à la fin de chaque ligne de balayage, stocker les données provenant de l'alignement CCD obtenues pour ce balayage de ligne, puis effacer les pixels de l'alignement CCD. Déplacer la position du laser. Focaliser dans la direction Y de la quantité déterminée précédemment.

Ensuite, balayer le faisceau laser dans la direction X à travers l'échantillon. Une fois encore, laisser l'obturateur du CCD ouvert et stocker les données. Répéter cette procédure de balayage en ligne jusqu'à ce qu'une zone physique d'environ 50 % plus grande que les dimensions d'une cellule biologique unique ait été illuminée par la lumière laser.

La relation entre le numéro de ligne d'une image de balayage linéaire particulière et la longueur d'onde doit être utilisée pour reconstruire les images et obtenir plusieurs cartes faciales d'intensités fluorescentes à différentes longueurs d'onde. Pour obtenir l'image de fluorescence émise pour une longueur d'onde donnée, repérez le numéro de ligne sur l'image obtenue lors du premier balayage linéaire qui correspond à cette longueur d'onde. Ensuite, la ligne adjacente de l'image de balayage linéaire suivante correspond à la ligne suivante de l'image de fluorescence émise.

Pour cette longueur d'onde particulière, regrouper toutes les lignes d'image correspondant à cette longueur d'onde afin d'obtenir les cartes spatiales d'intensité fluorescente XY de l'échantillon à cette longueur d'onde. Répéter cette procédure pour toutes les autres longueurs d'onde accessibles afin de recueillir des données sur vos échantillons. Premièrement, retirer de l'incubateur les plaques contenant les colonies de levure transformées.

Il devrait y avoir au moins trois types de cellules transformées. Des cellules exprimant les protéines d'intérêt marquées avec les deux types de sondes fluorescentes. Des cellules exprimant uniquement des protéines marquées avec les sondes fluorescentes donneuses et des cellules exprimant uniquement des protéines marquées avec les sondes fluorescentes acceptrices.

Ajoutez 100 microlitres de chlorure de potassium à 100 millimolaire dans un tube de microcentrifugeuse. Ensuite, à l’aide d’une micropipette, prélèvez trois à cinq colonies de levures à partir de la boîte de culture contenant des cellules exprimant des protéines marquées à la fois par un donneur et un accepteur de sondes fluorescentes, et inoculez-les dans le chlorure de potassium à 100 millimolaire. À partir de cette suspension cellulaire, retirez 10 microlitres et déposez-les sur une nouvelle lame de microscope.

Couvrez la goutte avec une lame couvre-objet et déposez une goutte d'huile sur la surface de la lame. Ensuite, fermez manuellement l'obturateur situé dans le trajet du faisceau laser afin d'empêcher la lumière laser d'atteindre l'objectif du microscope. Fixez la lame de microscope sur la platine de translation XY, Z et déplacez la platine dans la direction de l'axe optique jusqu'à ce que l'objectif du microscope entre en contact avec la goutte d'huile à immersion.

Activez maintenant l'éclairage lumineux en champ large et rendez-vous à la caméra. Passez en mode vidéo de collecte des données. L'image en champ large de l'échantillon sera fortement floue en raison de la présence du réseau de transmission dans le trajet d'émission.

Par conséquent, placez un filtre passe-bande ayant une petite largeur à mi-hauteur dans le trajet optique avant le réseau de transmission. Déplacez lentement la platine de translation dans la direction de l'axe optique tout en observant l'image des cellules sur l'écran de la caméra, jusqu'à ce que les cellules soient mises au point. Translatez la platine dans la direction X ou Y afin de positionner une cellule unique à l'emplacement du foyer du faisceau laser.

Éteignez la source d'illumination en champ large et retirez le filtre passe-bande du trajet d'émission. Débloquez le faisceau laser pendant une courte durée tout en visualisant simultanément le signal reçu par le réseau CCD. Si un signal fluorescent est détecté sur le réseau CCD pendant que le faisceau laser atteint la cellule, effectuez alors une numérisation complète d'acquisition de données fluorescentes pour cette cellule.

Il est essentiel d'utiliser les mêmes paramètres de balayage, en particulier le nombre de lignes et l'incrément de pas déterminés lors de la procédure d'étalonnage présentée précédemment. Répétez le processus de localisation des cellules et d'acquisition des données de fluorescence pour un grand nombre de cellules exprimant une protéine liée à la fois aux marqueurs donneurs et aux marqueurs accepteurs. Après avoir accumulé suffisamment d'images de fluorescence de cellules exprimant des protéines marquées avec les deux récepteurs, répétez l'ensemble du processus pour les cellules exprimant uniquement des protéines marquées avec les sondes fluorescentes donneurs et pour les cellules exprimant uniquement des protéines marquées avec les sondes fluorescentes accepteurs.

Enfin, reconstruire tous les balayages afin d'obtenir des cartes spatiales d'intensité fluorescente XY résolues spectralement pour chaque jeu de données, en utilisant la procédure décrite précédemment. Les trois figures ci-dessous illustrent les cartes spatiales résultantes calculées à partir de mesures de microscopie à deux photons résolues spectralement, effectuées sur une cellule de levure exprimant le récepteur stérile au facteur alpha. Des cartes bidimensionnelles des signaux du donneur et de l'accepteur ont été obtenues en analysant les profils d'émission spectraux provenant de chaque emplacement de la cellule.

Les intensités de fluorescence se voient attribuer des couleurs fausses en fonction de leurs valeurs, et l'échelle est indiquée sous forme d'encart. Une carte bidimensionnelle des efficacités de FRET apparentes a ensuite été calculée à l'aide des images KDA et KAD, en utilisant les valeurs extraites de la carte d'efficacités de FRET apparentes de la cellule ; un graphique en histogramme a alors été préparé. Les valeurs mesurées de EAPP de la cellule sont représentées par des cercles.

La ligne continue rouge représente l'ajustement optimal aux données mesurées à l'aide de la somme des fonctions individuelles de calcium représentées par les lignes vertes continues. L'analyse de l'histogramme, décrite dans le texte du protocole, confirme que le complexe stérile du récepteur du facteur alpha deux avec tous ses ligands adopte la forme d'un tétramère en forme de RBA in vivo. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 12 heures si elle est correctement exécutée.

Lors de la réalisation de cette expérience, il est important de maintenir la puissance de la source d'excitation à un niveau faible. Il est essentiel d'éviter une excitation multiple du donneur par une seule impulsion.