Dosage β-amyloïde toxicité utilisant un transgéniques C. elegans

L'objectif général de l'expérience suivante est d'évaluer la toxicité du peptide bêta-amyloïde dans un système modèle InVivo. La reproductibilité et la simplicité relative de ce test permettent un criblage rapide de médicaments, de conditions environnementales ou de modifications génétiques sur la toxicité du peptide bêta-amyloïde. Un facteur clé dans le développement de ce test est la génération de vers transgéniques de cl egan's avec une expression inductible par la température, spécifique aux muscles, du peptide bêta-amyloïde.

Cette expression sensible à la température est obtenue en construisant un transgène contenant une région non traduite trois prime anormalement longue, rendant l'ARNm du transgène cible du système de surveillance de l'ARNm. L'expression de ce transgène est donc faible chez les vers de type sauvage possédant un système de surveillance de l'ARNm fonctionnel, en raison de la dégradation de l'ARNm du transgène. Si ce transgène est introduit dans un fond génétique porteur d'une mutation dans un composant essentiel du système de surveillance de l'ARNm, l'expression du transgène sera nettement plus élevée. Si le fond génétique contient une mutation sensible à la température dans le système de surveillance de l'ARNm, alors la propagation de cette souche transgénique à la température non permise bloquera la dégradation de l'ARNm du transgène et entraînera une forte expression du transgène. Chez les vers transgéniques utilisant ce système pour réguler l'expression du peptide bêta-amyloïde dans les muscles pariétaux, une augmentation de la température de 16 degrés Celsius à 25 degrés Celsius provoque une accumulation importante du peptide bêta-amyloïde, un dysfonctionnement des cellules musculaires et la paralysie des vers. Mesure du temps.

Il faut une population de ces vers trenchgéniques pour devenir paralysés après une augmentation de température. Le test d'augmentation de température constitue un dosage sensible de la toxicité du bêta-amyloïde. Ceci est réalisé en préparant des boîtes fraîches de milieu de croissance pour nématodes destinées au dosage de la paralysie, ce qui permet de minimiser les variables environnementales pouvant influencer les taux de paralysie.

En second lieu, des populations âgées et synchronisées de vers transgéniques sont initiées, ce qui minimise les effets du stade de développement sur l'expression du transgène. Ensuite, des vers synchronisés au troisième stade larvaire sont transférés d'une température de 16 degrés Celsius à 25 degrés Celsius, ce qui augmente la stabilité de l'ARNm du transgène et conduit à l'accumulation du peptide bêta-amyloïde. La mesure du temps entre le transfert thermique et la paralysie de chaque ver permet d'évaluer la vitesse de dysfonction musculaire, permettant ainsi de tester les effets toxiques de l'accumulation du peptide bêta-amyloïde. Des résultats sont ainsi obtenus, montrant l'effet de traitements spécifiques sur la toxicité du peptide bêta-amyloïde exprimé de façon endogène.

Ainsi, le principal avantage de notre technique, par rapport à l'utilisation de modèles de souris transgéniques pour évaluer l'activité d'un médicament, est que nous pouvons réaliser notre méthode beaucoup plus rapidement et à moindre coût. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle. L'évaluation des vers L4 dans un test de paralysie est très difficile à apprendre.

Ainsi, lorsque vous évaluez un ver paralysé de stade L4, vous devez observer le mouvement isolé en halo de la région céphalique du ver. Dès que cette partie bouge alors que tout le corps du ver est paralysé, vous comptez ce ver comme étant paralysé. Les essais de paralysie sont réalisés sur des boîtes contenant le milieu standard de croissance des nématodes, ou NGM, couramment utilisé pour la propagation et l'analyse génétique de C. elegans.

Pour préparer les plaques, stériliser par autoclavage la solution de NGM contenant du chlorure de sodium, de l'agar et du peptide dans un flacon Erlenmeyer, puis ajouter les volumes appropriés des solutions stériles suivantes, indiquées dans le protocole écrit joint. Répartir 10 millilitres de NGM liquide dans chaque boîte de Pétri de 60 millimètres sur 15 millimètres. Laisser la NGM durcir toute la nuit à température ambiante.

Si l'on teste les effets de composés ou d'extraits, aliquoter l'extrait sur chaque plaque et utiliser un répandeur pour le répartir uniformément sur la surface de la plaque. Laisser les plaques sécher toute la nuit à température ambiante. Les volumes supérieurs à un millilitre nécessiteront davantage de temps pour sécher.

Déposer ensuite 250 microlitres de la souche d’E. coli OP50 cultivée pendant une nuit dans du milieu LB jusqu’à une densité optique comprise entre 0,4 et 0,6 sur chaque plaque, puis laisser les bactéries sécher une nuit à température ambiante. L’âge de la plaque influence de manière significative le taux de paralysie, et les plaques plus anciennes ont tendance à se dessécher. Les plaques doivent être préparées moins d’une semaine avant le test de paralysie.

Idéalement, vous devez utiliser des boîtes dont la couche de gélose a été coulée trois à quatre jours avant. Toutes les boîtes destinées à la ponte synchrone utilisées dans une expérience doivent provenir du même lot. Modifier la taille de la pelouse bactérienne et/ou le type de bactérie modifie également le comportement des vers. Les tests de paralysie peuvent être réalisés avec des souches alternatives d’E. coli. Par exemple, la souche HT115 est utilisée dans les expériences d’ARNi. Toutefois, cela peut modifier la cinétique du test de paralysie.

Par conséquent, vous devez utiliser des contrôles internes appropriés à la souche. La souche CL 476 est la plus couramment utilisée pour tester une paralysie induite par le bêta. Cette souche et d'autres modèles transgéniques sont disponibles pour les chercheurs académiques, moyennant des frais modiques, auprès du Centre génétique Saint Ahadi.

Pour maximiser la synchronisation d'âge de la population test, il est préférable de commencer avec une génération parentale synchronisée. Une semaine avant d'initier le test de paralysie de la population test, utilisez un prélèveur de nématodes en platine pour transférer de 20 à 30 adultes gravides sur plusieurs plaques NGM de 10 centimètres.

Étaler avec OP50 pour une ponte de deux heures à 16 degrés Celsius, qui est la température permise pour CL4176. Retirer les adultes GR et laisser la descendance se développer pendant sept jours, au bout desquels ils seront des adultes âgés de deux jours. Adultes âgés de deux jours.

Les adultes sont utilisés pour préparer les populations témoins âgées synchrones pour chaque condition expérimentale. L'objectif est de générer des plaques en triple exemplaire contenant de 50 à 75 vers âgés de façon synchrone à l'aide d'un prélévateur de vers en platine. Transférez 10 à 12 adultes de deux jours sur des plaques NGM de 60 millimètres ensemencées avec OP50. Laissez les vers pondre leurs œufs à 16 degrés Celsius pendant deux heures, puis retirez les adultes et laissez les œufs éclore et se développer à 16 degrés Celsius.

À ce stade, il est préférable que quelqu’un qui ne sera pas chargé de l’évaluation des boîtes les code afin que l’analyse soit effectuée à l’aveugle par rapport aux conditions expérimentales. Le stade de développement embryonnaire au moment où les œufs sont pondus, qui correspond approximativement au stade à 26 cellules pour les vers de type sauvage dans des conditions optimales, dépend de l’âge des adultes et de leur nutrition. Si les adultes soumis à la gravité utilisés pour la ponte sont plus âgés ou ont subi une privation alimentaire, des œufs à un stade plus avancé seront pondus et la population synchronisée ne sera pas obtenue, ce qui affectera la cinétique du test de paralysie.

Il est essentiel d'utiliser des cultures bactériennes monogéniques telles que e coli, OP 50, car toute contamination bactérienne peut gravement affecter ce test. La reproductibilité est maximale si vos plaques en triplicata contiennent un nombre similaire de vers pour induire le transgène et réaliser le test de paralysie. Augmenter la température des plaques à 25 degrés Celsius.

48 heures après la fin de la ponte synchronisée, les vers doivent se trouver au stade larvaire troisième. Les boîtes doivent être disposées sans être empilées dans un incubateur à 25 degrés Celsius afin de permettre aux boîtes d'atteindre cette température. En même temps, commencez à évaluer la paralysie des vers 18 à 20 heures après le début de la montée en température.

À ce stade, tous les vers de la population doivent avoir atteint le quatrième stade larvaire ; poursuivez le comptage par incréments de deux heures jusqu'à ce que tous les vers sur chacune des boîtes soient paralysés. Pour des raisons inconnues, la paralysie ne se répartit pas uniformément sur toute la longueur du corps. La région de la tête est la dernière partie du ver à cesser de bouger.

Ainsi, les vers qui ont récemment commencé à être paralysés ne peuvent pas se déplacer sur la plaque, mais peuvent bouger la tête, ce qui leur permet d'éliminer les bactéries autour de leur extrémité antérieure et de laisser un halo de bactéries éliminées. Ces vers deviendront inévitablement complètement paralysés et sont donc caractérisés comme paralysés. Certains vers n'auront pas de halo, mais ne présenteront pas non plus de mouvement spontané.

On les teste en les piquant avec le curet à vers. Si un ver piqué ne peut pas effectuer une propagation complète de l'onde corporelle après le piquage, il est également considéré comme paralysé afin d'assurer une évaluation efficace. Il est plus facile de déplacer les vers paralysés vers un secteur non utilisé de la boîte, afin qu'ils ne soient pas évalués par erreur lors du prochain cycle d'évaluation.

Cela permet également aux vers mal classés de démontrer des mouvements, permettant ainsi une correction du score pour générer une courbe de paralysie. À chaque point temporel, la fraction de vers sur chaque plaque qui n'ont pas été paralysés est convertie en pourcentage, et le pourcentage moyen non paralysé est tracé en fonction du temps à partir du moment où l'augmentation de température a été initiée. La courbe obtenue est formellement analogue à une courbe de survie et peut donc être analysée à l'aide de statistiques non paramétriques classiques de survie.

Le passage des vers transgéniques myo trois A bêta à une température plus élevée doit être effectué au milieu du stade L quatre afin que la paralysie commence. Le promoteur Myo trois est régulé au cours du développement. Une fois que les vers ont atteint le stade L quatre tardif ou l'âge adulte, le niveau d'expression a considérablement diminué.

L'expression du transgène est bloquée si les vers sont privés de nourriture, il est donc très essentiel que les vers soient bien nourris tout au long de l'expérience. Nous n'avons jamais observé qu'un ver paralysé récupère, quelle que soit la condition. Après 12 à 16 heures de passage à une température supérieure, CL 41 76 deviendra paralysé, indépendamment du fait que vous le repassiez à 16 degrés ; chez la souche CL 41 76, la surexpression de l'expression du transgène responsable de la paralysie peut survenir à des températures plus basses.

Toutefois, veuillez noter que le taux de paralysie sera affecté dans son timing. Le taux de paralysie dépend de la souche transgénique spécifique utilisée. Nous avons construit des souches myo trois A bêta dont le taux de paralysie est plus rapide ou plus lent que celui de la CL 41 76, et par conséquent, vous devez ajuster votre fenêtre d'évaluation pour le test de paralysie en conséquence.

On voit ici un graphique de la courbe de paralysie pour CL 4 1 76, non traité et exposé à de la caféine à 6,27 millimolaire. Ce traitement entraîne un retard hautement significatif sur le plan statistique de la paralysie d'environ quatre heures, que nous interprétons comme un indice de la suppression d'une toxicité bêta. Dans ce modèle, cette expérience a évalué les effets d'ol un autre composé présent dans le café.

Le tracé est typique des traitements qui n'affectent pas la toxicité bêta. Notez que dans les deux expériences, environ la moitié des populations non traitées de CL 4 1 76 sont paralysées au bout de 24 heures et la paralysie est complète à 28 heures. Ce sont des délais typiques pour la paralysie du témoin.

Des écarts significatifs par rapport à ce calendrier chez les populations CL 4 1 7 6 indiquent des conditions environnementales modifiées ou une suppression spontanée de copies du transgène. Consulter le protocole associé pour obtenir des informations supplémentaires sur la souche CL 4 1 7 6. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de prendre en compte l'âge des boîtes, le stade de la population de vers et la capacité à évaluer le taux de paralysie des vers.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser ce système à *C. elegans* pour évaluer avec précision la toxicité de l'amyloïde bêta. Vous devriez être en mesure de détecter des effets assez subtils de divers traitements environnementaux ou médicamenteux sur cette toxicité. Les variables que nous avons abordées sont importantes à prendre en compte, car elles vous permettront de réaliser le test de manière très reproductible et avec une cinétique de paralysie constante.

Cela est en réalité très important si vous souhaitez comparer vos résultats obtenus dans votre laboratoire à différents moments et par différentes personnes, ou comparer vos résultats à ceux d'autres chercheurs utilisant ce système modèle.