Agar-Block microcosmes pour la décomposition des tissus végétaux contrôlés par des champignons aérobie

L'objectif général de cette procédure est d'ensemencer un champignon aérobie dégradant le bois dans un microcosme en boîte de Pétri où l'humidité du bois et les substrats exogènes sont strictement contrôlés. Cela est réalisé en préparant d'abord des microcosmes avec des volumes précis de milieux connus. Ensuite, le bois à dégrader, ainsi que tout substrat solide exogène, sont disposés au-dessus d'une grille en plastique située à la surface de l'agar, sans permettre de contact entre les substrats.

Le microcosme est ensuite inoculé et incubé avec le champignon test. Après l'incubation, les blocs de bois sont récoltés afin de déterminer la perte de masse et de préparer les tissus pour les analyses. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent le degré de biodégradation du bois et le rôle des sources exogènes d'éléments par des mesures de perte de masse, des observations de la morphologie du mycélium et des analyses élémentaires ciblées telles que la spectroscopie de plasma couplé inductivement.

Bonjour, je m'appelle Brooke Jacobson du laboratoire du Dr Jonathan Schilling du Département de génie des bioproduits et des biosystèmes à l'Université du Minnesota. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure utilisant des boîtes de Petri comme microenvironnements pour la décomposition des tissus végétaux par des champignons aérobies. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les mécanismes de décomposition fongique de la lignocellulose.

La lignocellulose est le tissu végétal composé de lignine, de cellulose et d'hémicellulose. Le tissu que nous étudions le plus souvent est le bois. Les erreurs liées aux aspects moins techniques de la conception du bloc à tarière sont les causes les plus fréquentes d'échec et les principales sources de variabilité entre les études, ce qui rend la publication vidéo de notre montage de bloc à tarière particulièrement utile. Nous savons par expérience que cette procédure donne des résultats de haute qualité et à faible variabilité.

Commençons donc. Pour ces expériences, utilisez des boîtes de Pétri d'un centimètre de profondeur supplémentaire par rapport aux boîtes de Pétri classiques afin d'augmenter l'espace libre au-dessus du bloc de bois dans le microcosme.

Commencez la préparation du microcosme en préparant suffisamment de milieu pour 20 millilitres par boîte de Pétri, sans calcium ni fer. Ajoutez 15 grammes d'agar dans une fiole jaugée de 500 millilitres contenant environ 400 millilitres d'eau déionisée enrichie avec des suppléments. Utilisez des solutions mères préparées au préalable pour ajouter les micronutriments au mélange.

Une fois les nutriments ajoutés, compléter jusqu'au trait de 500 millilitres dans la fiole jaugée. Ensuite, transférer le milieu dans une fiole de 1000 millilitres. Stériliser au autoclave à 121 degrés Celsius et 16 PSI pendant 20 minutes.

Veillez à ne pas dépasser un volume de 500 millilitres par flacon afin d'éviter que l'agar ne se solidifie avant l'administration des plaques de test. Après la stérilisation à l'autoclave, laissez refroidir le milieu jusqu'à ce qu'il soit tiède au toucher afin de minimiser la condensation. La réduction de l'humidité est essentielle dans ces expériences, car la teneur en humidité ou mc.

Plus de 80 % provoqueront une anoxie dans les tissus. Limitez la décomposition par les champignons aérobies et augmentez la variabilité une fois. Refroidissez. Utilisez un aide-pipette portable et des pipettes stériles en polystyrène de 10 millilitres pour effectuer une asepsie.

Transférez l'agar dans une pile élevée de boîtes de Pétri à l'intérieur d'une hotte de sécurité biologique. Ensuite, découpez généreusement des grilles en plastique pour qu'elles s'ajustent à l'intérieur des fonds de boîtes. Après avoir découpé les grilles et les avoir bien lavées avec du savon et de l'eau, préparez-les pour le séchage et la stérilisation en autoclave pour cette démonstration.

Le pin jaune du Sud ou SYP est utilisé car il représente une source importante de bois d'œuvre. Dans la construction résidentielle aux États-Unis, utilisez du bois non traité et découpez des blocs sans nœud de 19 sur 19 millimètres à partir d'une seule coupe longitudinale dans le sens du fil. Découpez cette longueur en blocs cubiques de 19 millimètres.

Divisez les blocs de 19 millimètres cubes en deux, dans le sens du fil, à l’aide d’un ciseau à bois et d’un marteau plutôt qu’avec une scie. Cela permet d’obtenir un bord rugueux à orienter vers le bas sur la maille plastique du microcosme en bloc agricole, et un bord supérieur lisse servant à l’étiquetage. Identifiez le bord lisse des blocs au crayon, découpez un nombre suffisant de blocs pour satisfaire aux différents traitements ainsi qu’aux témoins non inoculés, qui serviront à la fois de contrôle de contamination et d’échantillons de référence conditionnés en parallèle à partir de matériau séché à l’étuve. Placez les échantillons dans des plaques en aluminium et introduisez-les dans une étuve à convection à 100 degrés Celsius pendant 48 heures.

Transférez les échantillons du four à un dessiccateur pour les refroidir une fois. Refroidissez. Pesez préalablement les échantillons afin de déterminer leur masse sèche initiale. Enfin, préparez les échantillons, y compris les grilles en plastique et le bois, pour l'autoclave en les enveloppant étroitement avec du papier d'aluminium afin de minimiser l'humidification.

Cela ne nécessite pas que chaque échantillon soit emballé individuellement, mais que l'exposition à la vapeur soit faible et constante. Stériliser les échantillons étiquetés en autoclave à 121 degrés Celsius et 16 PSI pendant une heure. Dans une cabine de sécurité biologique stérile, assembler des AE vides, une plaque source pour le substrat végétal en maille d'inoculum matériaux exogènes, des bandes de paraforme Sharpie, des pinces et des outils de transfert.

L'étape suivante de l'inoculation consiste à ajouter les éléments à l'agar, en manipulant les boîtes de Pétri pour minimiser le risque de contamination. Stérilisez les outils de transfert et les pinces avec de l'éthanol à 95 % au fur et à mesure de leur utilisation. Ajoutez d'abord la maille en plastique dans la boîte de Pétri.

Ensuite, ajoutez le substrat de bois ici. Deux blocs de bois sont placés le long de la longueur du maillage afin que les données puissent être appariées entre les récoltes précoces et tardives. Ces blocs sont disposés côte à côte, avec le fil du bois orienté vers le point d'origine de l'inoculum fongique.

Ensuite, ajoutez les matériaux exogènes ici. Le rôle du gypse est testé concernant la dégradation par un champignon filamenteux. Par conséquent, le champignon doit rencontrer ces disques de gypse avant d'atteindre le bois.

Un disque de gypse est ajouté entre chaque bloc et chaque point d'inoculum, au-dessus du treillis. Veiller à éviter tout contact entre les disques dans le bois tout en les maintenant proches les uns des autres. Pour l'inoculum fongique, utiliser un tire-bouchon numéro quatre de diamètre sept millimètres afin de prélever des broches à partir de cultures de deux semaines développées dans 20 millilitres d'agar.

Cela permet de contrôler le volume de l'inoculum. Pour les témoins non inoculés, il est préférable d'ajouter un fragment provenant d'une plaque stérile. Évitez tout contact entre l'inoculum et les substrats exogènes ou le bois, mais placez-les proches les uns des autres.

Utilisez un inoculum par bloc. Scellez les boîtes avec du parafilm découpé à l’aide d’un rasoir, maintenez les boîtes horizontales et enroulez le parafilm d’un mouvement régulier et continu. Enfin, étiquetez les couvercles des boîtes à l’aide d’un marqueur résistant à l’alcool en indiquant les numéros des blocs directement au-dessus des substrats respectifs.

Dessinez également des cercles sur les disques de gypse. Transférez soigneusement les boîtes dans une étuve biologique afin d'éviter de secouer leur contenu et de minimiser la condensation due aux fluctuations de température. Les conditions utilisées ici sont de 20 degrés Celsius et à l'obscurité ; effectuez des récoltes en série chronologique de manière aseptique, sauf pour la dernière récolte.

Au prélèvement de la semaine cinq, retirez l'ensemble du lot traité. Vaporisez chaque face inférieure et supérieure avec de l'éthanol à 70 % et utilisez des pinces flambées pour retirer le matériel à l'intérieur de la cabine de sécurité biologique. Prenez des photographies avant de détruire les plaques agricoles, en ciblant tout morph F ou melon.

Ensuite, retirez les blocs à traiter. Éliminez tout excès de pha, mais faites attention de ne pas perdre de matériau en décomposition dans le four. Séchez les blocs dans des plaques en aluminium et déterminez la perte de masse à l’aide des masses fraîches et sèches des témoins afin de surveiller un capillarité excessive.

Les données de perte de masse aident à évaluer l'avancement de la décomposition et constituent des informations importantes. Si l'on souhaite calculer les concentrations élémentaires sur la base d'un poids en grammes, les données en pourcentage doivent être normalisées. Pour les analyses statistiques, étiquetez et suivez tous les blocs brun foncé, qui sont clairement saturés d'eau.

Enfin, détruisez les cultures dans des sacs autoclavables, en conservant le treillis en plastique et tous les autres composants pouvant être recyclés pour une utilisation dans des expériences futures. Dans le dispositif microcosme du bloc agri, les blocs de bois de pin reposent sur un treillis en plastique afin d'élever les blocs au-dessus du contact agri. Les Crains circulaires ont poussé en contact direct avec les surfaces de gypse et pénétré à l'intérieur des blocs de bois.

Ce mycélium représente une connexion importante entre le bois et les sources d'éléments nutritifs exogènes. Le contrôle de ces sources de matériaux exogènes dans l'agar ou dans des matériaux solides constitue un avantage clé d'un dispositif en bloc agricole par rapport à un dispositif en bloc de sol, la perte de poids moyenne en pourcentage servant de mesure du degré de décomposition du bois par Ser crain's après cinq et quinze semaines. L'incubation avec du pin dans des microcosmes en bloc agro est illustrée ici.

Aucun traitement n'a été appliqué. Du chlorure de calcium à 5 millimolaire a été ajouté à de l'agar contenant plus de 99 % de gypse pur ou du gypse enrichi à 1 % en fer ; pour chaque récolte, les barres portant la même lettre ne sont pas significativement différentes. Compte tenu des barres d'erreur représentant l'écart type, une perte de poids supérieure à 60 % a été observée dans les témoins constitués de blocs de pin attaqués par la pourriture brune, ce qui satisfait l'objectif fixé par la norme de la Society of Testing and Materials américaine, à savoir une dégradation supérieure à 50 %.

Le coefficient moyen de variation de la dégradation était de 0,055 à la semaine 16. Outre une faible variabilité, un effet du traitement a été observé. La dégradation fongique a été inhibée par l'ajout de calcium, que celui-ci soit apporté sous forme de chlorure de calcium dans l'agar ou sous forme de gypse pur.

Curieusement, les taux de décomposition augmentent avec l'ajout de fer au gypse. Cela suggère que le fer, et non le calcium, est essentiel pour observer les cinq réplicats à la semaine 15 de la décomposition. Par le même champignon de pourriture brune, champignon témoin, les lamines circulaires, la couleur des mycéliums révèle mein.

Des différences au niveau des hyphes externes entre les traitements ont été observées ; les blocs ont été retirés, soulevés et séchés. Cela a révélé l'absence de mein dans le traitement sans calcium. Le jaunissement dans les traitements au calcium pur et l'apparence rouillée dans le traitement enrichi en fer.

Le témoin représente des blocs non inoculés à des fins de comparaison. Fait intéressant, les effets principaux disparaissent lorsqu'on utilise un milieu riche en fer. Dans leur ensemble, ces résultats suggèrent que ce champignon utilise le fer, et non le calcium.

Dans ces matériaux, nous venons de vous montrer comment utiliser un montage avec blocs forets afin de tester avec succès la biodégradation de tissus végétaux par des champignons filamenteux aérobies. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de veiller à ce que les substrats ne soient pas en contact les uns avec les autres, en particulier le tissu végétal et le foret, afin de minimiser la teneur en humidité du foret et des plaquettes, et de vérifier soigneusement que le contenu de chaque boîte n’a pas bougé avant l’incubation. En tenant compte de ces variables, vous pouvez contrôler l’environnement de décomposition bien mieux que lorsque vous utilisez un montage avec blocs de sol.

Vous pouvez générer des données avec une puissance statistique suffisante pour répondre à vos questions de recherche. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.