Cristallisation des protéines pour la cristallographie aux rayons X

L'objectif général de cette procédure est de produire des cristaux de protéines destinés à des expériences de diffraction des rayons X. Trois techniques différentes de criblage cristallin sont présentées : les méthodes de cristallisation par diffusion de vapeur, incluant la goutte suspendue et la goutte posée, ainsi que les méthodes de cristallisation en micro-batch. Pour la cristallisation par diffusion de vapeur, les puits sont remplis de précipitant.

Ensuite, un échantillon de protéine purifiée à forte concentration est mélangé avec l'agent de précipitation. La gouttelette mixte est ensuite scellée dans une cavité contenant la solution de précipitant. La cristallisation en micro-batch commence par le remplissage de la cavité avec de l'huile de paraffine.

La protéine est ensuite chargée dans les puits, suivie par la solution précipitante. La dernière étape de toutes les méthodes consiste à laisser le système équilibrer et à suivre l'apparition et la croissance des cristaux au sein des gouttes. En fin de compte, des cristaux peuvent être obtenus grâce à cette technique et le motif de diffraction de la protéine peut être déterminé à l'aide d'une source de rayons X munie d'un détecteur approprié.

Bonjour, je suis Sal du laboratoire du professeur Yoga Motis, du Département de biophysique moléculaire et de biochimie de l'Université Yale. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure de cristallisation d'une protéine purifiée. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les bases structurales de l'infection virale.

Commençons donc et cultivons quelques cristaux. Pour déterminer une méthode de cristallisation adaptée à une macromolécule choisie, des criblages initiaux peuvent être réalisés à l’aide de solutions de cristallisation disponibles dans le commerce, sélectionnées afin d’exploiter la méthode matricielle éparse et factorielle incomplète des conditions d’essai. Ces conditions sont choisies en fonction de conditions de cristallisation connues et couramment efficaces pour les macromolécules.

Une fois la condition de cristallisation connue, on peut concevoir un tamisage étroit en faisant varier la concentration du précipitant et le pH autour du résultat initial. En général, les conditions de cristallisation utilisées pour ces tamisages comprennent un agent précipitant et un tampon permettant de régler le pH ; toutes les solutions mères doivent être filtrées à travers un filtre de 0,22 micron pour cette démonstration. Les conditions de cristallisation précédemment identifiées pour la lysozyme de poulet sont utilisées, avec du chlorure de sodium comme précipitant. Commencez la procédure en préparant un millilitre de solutions à diverses concentrations de chlorure de sodium dans de l'acétate de sodium 0,1 molaire et à différents pH.

Ensuite, décongeler l'échantillon de protéine stocké à moins 80 degrés Celsius et le maintenir sur de la glace. Les concentrations typiques de protéines se situent dans la fourchette de cinq à 50 milligrammes par millilitre, les concentrations plus élevées donnant généralement de meilleurs résultats. Ici, une solution de 50 milligrammes par millilitre de lysozyme d'œuf de poule dans de l'acétate de sodium 0,02 molaire à pH 4,9 est utilisée.

Faire centrifuger l'échantillon pendant 15 minutes à 18 000 G et à quatre degrés Celsius afin d'éliminer les protéines partiellement agrégées ou tout précipité résultant de l'étape de décongélation. Ces agrégats peuvent interférer avec la croissance des cristaux et favoriser un agrégation supplémentaire. Après la centrifugation.

Déterminez la concentration en protéines à partir de son absorbance à 280 nanomètres en utilisant un spectrophotomètre UV. La concentration en protéines peut être calculée à partir de la mesure d'absorbance et du coefficient d'extinction de la protéine. Une fois l'échantillon de protéine prêt, remplissez une plaque de cristallisation en goutte suspendue à 24 puits avec 500 microlitres de solution de précipitant selon le schéma de la plaque.

Créez un anneau de graisse silicone autour du bord de chaque puits sans fermer parfaitement l'anneau afin de permettre l'échappement de l'air lors de la fermeture du puits. Nettoyez la lame couvre-objet à l’aide d’un aérosol d’air comprimé ou d’un chiffon professionnel pour éviter la poussière, ce qui facilitera l’interprétation des gouttes de cristallisation et éliminera les contaminations. L’étape suivante consiste à pipeter des volumes égaux de l’échantillon protéique et de la solution du réservoir sur la lame couvre-objet.

Cependant, différents volumes de protéine et de précipitant peuvent être testés dans le cadre du processus d'optimisation ; l'utilisation d'une quantité de protéine supérieure à celle du précipitant entraîne une concentration nette de la protéine dans la goutte équilibrée, ce qui peut être souhaitable pour des échantillons de protéines peu concentrés ou pour ralentir la nucléation ou la croissance des cristaux. Pour cette démonstration, deux microlitres de lysozyme à 50 milligrammes par millilitre dans de l'acétate de sodium 0,02 molaire, pH 4, sont déposés au centre de la lame couvre-objet, suivis de deux microlitres de solution de cristallisation.

Lors du pipetage de la solution protéique et de la solution réservoir sur la lame couvre-objet, faites très attention pour éviter la formation de bulles, ce qui se produit souvent lorsque de l'air est expulsé de la pipette. Mélangez doucement la goutte pour aider à prévenir une précipitation prématurée des protéines due à des concentrations localement élevées de précipitant ; ce mélange est particulièrement important pour les précipitants visqueux tels que le polyéthylène glycol à l'aide de pinces. Retournez délicatement la lame couvre-objet et posez-la sur l'anneau de graisse en haut du puits ; effectuez cette opération de manière directionnelle afin de permettre à l'air de s'échapper du puits.

Sinon, l'air peut soulever la lame couvre-objet, compromettant l'étanchéité du puits. Passez au puits suivant jusqu'à ce que le plateau soit complet. Une fois le plateau préparé, inspectez-le visuellement afin d'éliminer les particules de poussière et autres contaminants qui pourraient augmenter l'identification erronée de faux cristaux de protéines.

Utilisez une fiche de notation pour documenter l'expérience. Ensuite, placez le plateau à la température d'incubation souhaitée, généralement comprise entre quatre degrés Celsius et la température ambiante. La température la plus efficace est de 20 degrés Celsius.

Manipulez délicatement la boîte et évitez tout secouement, toute vibration ou tout changement de température pendant le transfert ou l'incubation, car cela pourrait empêcher la croissance des cristaux ou nuire négativement à leur qualité. Vérifiez la présence de cristaux dans la boîte le jour suivant, puis tous les quelques jours, en manipulant toujours les boîtes avec précaution. Documentez toutes les observations et les morphologies des gouttes sur une fiche de notation spécifique à la boîte.

Les cristaux apparaissent généralement en deux à cinq jours, bien qu'ils puissent parfois se former presque immédiatement ou plusieurs mois plus tard. Une fois les conditions de cristallisation identifiées et la vitesse de croissance des cristaux connue, il est préférable de ne pas déranger les plaques jusqu'à ce que les cristaux soient visibles et aient atteint au moins la moitié de leur taille finale. Laisser les plaques au repos peut réduire le nombre d'événements de nucléation cristalline, conduisant ainsi à un nombre moindre de cristaux plus gros. Pour la cristallisation en goutte suspendue, suivez la même procédure que pour la goutte pendante, sauf que nous utiliserons une plaque de cristallisation en goutte déposée à 24 puits, pour laquelle des lamelles de couverture ne sont pas nécessaires.

Au lieu de cela, la cavité contient une plateforme sur laquelle on mélange la protéine et l'agent de précipitation à l'aide d'une pipette : déposez deux microlitres d'une solution de lysozyme à 50 milligrammes par millilitre au centre de la plateforme, en évitant la formation de bulles d'air. Ensuite, ajoutez deux microlitres de solution d'agent de précipitation à l'échantillon après la mise en place de la plaque. Scellez les cavités avec du ruban optique en utilisant la méthode de la goutte suspendue.

Aucun coverslip n'est nécessaire. Poursuivre l'incubation et l'évaluation des cristaux comme décrit pour la méthode de goutte suspendue. Pour réaliser une procédure en micro-batch.

Préparez la solution de cristallisation et la protéine comme décrit pour la méthode de goutte suspendue. Procurez-vous un nouveau plateau pour micro-essai par batch et utilisez un aérosol d'air pour éviter la poussière et d'autres particules grossières dans le plateau. Ajoutez de l'huile de paraffine dans chaque puits jusqu'à une profondeur de trois millimètres.

Ensuite, retirez l'excès d'huile. Puis, chargez un microlitre de la solution protéique dans le puits prérempli, en veillant à ce que la goutte descende au fond du puits. Chargez ensuite un microlitre de la solution de précipitant dans le puits.

Veillez à ce que la goutte sédimente au fond du puits et fusionne avec la goutte de protéine. Passez au puits suivant jusqu'à ce que la plaque soit complète, puis poursuivez avec l'incubation et l'analyse des cristaux comme décrit ici. Résultats typiques de la cristallisation des protéines.

Des expériences sont présentées. Un précipité amorphe se forme lorsque la protéine et/ou le précipitant sont à forte concentration. En revanche, les gouttes non saturées restent généralement limpides.

Une séparation de phase peut survenir si la protéine ou le détergent passe dans une phase différente lorsqu'il est mélangé à certains précipitants à forte concentration. Dans des conditions optimales, des cristaux de protéine doivent se former chez Arabidopsis csn. Sept cristaux de protéine obtenus dans du polyéthylène glycol 8 000 et de l'acétate de magnésium présentent une forme allongée.

Les cristaux illustrés sont des cristaux de protéines lysosomales obtenus dans une solution d'un molaire de chlorure de sodium et d'acétate de sodium, à un pH de 4,9. Ce film en accéléré montre que les cristaux lysosomaux se développent en de grands prismes en quelques heures seulement après la mise en place par la méthode de la goutte suspendue.

Nous venons de vous montrer comment configurer une expérience sur les protéines lorsque vous effectuez cette procédure. Il est important de travailler dans un environnement où la température et l'humidité sont rigoureusement contrôlées, car une humidité élevée permet de minimiser l'évaporation de la goutte. Essayez d'adopter une technique qui réduit au minimum l'exposition de la goutte à l'air libre. Pour cette raison, il est essentiel de travailler dans un environnement bien organisé.

Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.