Stratégie de transfection optimisés pour l'expression et l'enregistrement électrophysiologique des recombinants canaux ioniques voltage-dépendants présents au HEK-293T

L'électrophysiologie est couramment utilisée pour étudier l'activité de canaux ioniques voltage-dépendants recombinants dans des cellules rénales embryonnaires humaines en culture. Un enregistrement réussi nécessite que les cellules expriment les canaux à des niveaux suffisants au niveau de la membrane cellulaire pour permettre leur détection, et qu'elles soient ensemencées à une densité cellulaire suffisamment faible pour isoler des cellules individuelles. La réalisation d'enregistrements cellulaires est fréquemment entravée par les longues périodes d'incubation à 28 degrés Celsius nécessaires à cette expression, durant lesquelles on observe généralement une perte d'adhésion cellulaire et une instabilité membranaire.

Ici, une méthode optimisée de culture cellulaire et de transfection est présentée, permettant de contourner ces problèmes. Les cellules sont transfectées à une confluence modérée, puis incubées à 28 degrés Celsius jusqu'à ce qu'une expression adéquate des canaux ioniques soit obtenue. Les cellules transfectées sont ensuite ensemencées sur des lamelles de verre à faible densité et incubées à 37 degrés Celsius pendant plusieurs heures afin de permettre l'attachement cellulaire et la stabilisation de la membrane.

Les cellules correctement ensemencées sont ensuite identifiées par l'expression concomitante d'EGFP et par enregistrement en configuration whole cell (enregistrement en mode cellule entière). L'enregistrement peut être effectué ou bien les cellules peuvent être à nouveau incubées à 28 degrés Celsius. Afin d'augmenter davantage l'expression membranaire des canaux, les résultats d'expériences d'enregistrement réalisées sur des cellules transfectées avec des canaux calciques activés par le voltage, tels que L CAV un, L CAV deux ou L cav trois, indiquent que les canaux ont été transférés et exprimés avec succès par les cellules.

Bien que seuls des résultats représentatifs pour L CAV trois soient présentés dans notre laboratoire, nous avons mis au point une méthode permettant d'augmenter l'expression de gènes de canaux ioniques faiblement exprimés pour l'enregistrement en configuration patch clamp dans des lignées cellulaires humaines. L'approche classique consiste à diviser d'abord les cellules sur des lamelles et à les transfecter avec des ADN plasmidiques contenant les gènes de canaux ioniques, puis à les incuber pendant plusieurs jours à 28 degrés Celsius afin d'obtenir une expression efficace des canaux ioniques avant l'enregistrement électrophysiologique. Notre nouvelle approche réduit considérablement le temps d'incubation requis à 28 degrés Celsius avant l'enregistrement.

En réduisant maintenant la durée d'incubation à 28 degrés, nous constatons que les membranes cellulaires sont beaucoup plus stables et que les cellules transfectées adhèrent bien davantage aux lamelles. Cela augmente le nombre de cellules enregistrables et rend les expériences significativement plus efficaces. Avant la transfection, divisez un flacon entièrement confluant de cellules HEK 293T, au ratio de un à quatre, dans un nouveau flacon de 25 centimètres carrés et placez les cellules dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Laisser les cellules s'attacher pendant trois à quatre heures ; après quatre heures, examiner les cellules en contraste interférentiel différentiel afin de vérifier l'attachement. Remarquer que les cellules n'ont plus une forme ronde et s'aplatissent. Des prolongements ou des pseudopodes sont visibles.

Les cellules moins confluentes auraient le même aspect, mais seraient espacées plus largement. Une fois que les cellules se sont attachées, associez les réactifs nécessaires pour effectuer une transfection par phosphate de calcium standard. Préparez un total de 12 microgrammes d'ADN dans 600 microlitres de solution de transfection par flacon.

Ici, des ADNc provenant de divers canaux ioniques sont clonés dans le plasmide P-I-R-E-S contenant deux EGFP. La transfection de ce vecteur d'expression dans une lignée cellulaire de mammifère entraîne la production de la protéine fluorescente verte améliorée à partir du même ARNm que l'insert cloné, par une traduction initiée au niveau d'un site d'entrée interne des ribosomes situé juste en aval de la séquence codant pour le canal ionique et en amont de la séquence codant pour EGFP. Cela permet d'identifier les cellules transfectées positivement sans risque d'interférence avec la fonction protéique, interférence qui pourrait survenir si la protéine EGFP était directement fusionnée à la protéine d'intérêt.

Verse la solution de transfection goutte à goutte sur les cellules, puis agite doucement le flacon et place-le dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant toute la nuit. Le lendemain, vérifie l’efficacité de la transfection en observant les cellules au microscope à fluorescence. Les cellules correctement transfectées doivent apparaître vertes dans toute la cellule.

Une fois la transfection vérifiée, pipetez soigneusement quatre à cinq millilitres de milieu tiède dans le flacon retourné. Lavez les cellules en tournant lentement le flacon de manière à ce que la surface cellulaire se retrouve vers le bas, puis en l'agitant doucement pour que la solution de lavage circule délicatement sur les cellules. Retirez le milieu et répétez ce lavage.

Répétez l'étape deux fois supplémentaires. Ensuite, ajoutez six millilitres de milieu dans l'flacon et incubez à 37 degrés Celsius pendant deux heures. L'expression des canaux ioniques d'invertébrés présente certains défis.

Tout d'abord, elles sont souvent de grande taille et peuvent par conséquent prendre beaucoup de temps pour être traduites au niveau du réticulum endoplasmique. De plus, elles peuvent ne pas être correctement dirigées vers la membrane cellulaire dans une lignée cellulaire de mammifère. Enfin, comme différentes espèces présentent des fréquences d'utilisation des codons différentes, les ARNc hétérologues peuvent contenir des fréquences élevées de codons peu courants dans les cellules de mammifères, tels que les cellules HEK 293T, afin de surmonter certaines de ces difficultés.

Après l'incubation de deux heures à 37 degrés Celsius, suivie du lavage de la transfection, transférez les flacons dans un incubateur à 28 degrés Celsius pendant deux à six jours afin de prolonger la période d'expression. Le temps d'incubation doit être déterminé empiriquement pour chaque type de canal ionique exprimé. En effet, une incubation prolongée à 28 degrés Celsius entraîne un détachement cellulaire et une faible stabilité membranaire.

Une préparation supplémentaire des cellules est nécessaire avant de réaliser des études électrophysiologiques. Tout d'abord, retirez le milieu des cellules transfectées à l'aide d'une pipette d'aspiration, puis introduisez un millilitre de solution de trypsine à 37 degrés Celsius dans un flacon retourné. Replacez ensuite délicatement le flacon en position horizontale, la surface cellulaire vers le bas, afin de permettre à la trypsine de s'écouler doucement sur les cellules.

Retournez à nouveau le flacon et retirez la trypsine. Ensuite, ajoutez 250 microlitres de trypsine tiède directement sur les cellules et incubez à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes, jusqu’au détachement des cellules. Pendant ce temps, placez trois à huit lamelles recouvertes de poly-L-lysine dans une boîte de culture de 60 millimètres et ajoutez cinq millilitres de milieu de culture tiède.

Une fois que les cellules se sont détachées, resuspendez-les dans quatre millilitres de milieu chaud en pipetant de haut en bas environ six fois. Ensuite, à l’aide de l’embout de la micropipette, appuyez doucement sur les lamelles pour vous assurer qu’elles sont bien au fond de la boîte. Ajoutez alors 250 à 500 microlitres de cellules resuspendues. Incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant trois heures afin de leur permettre d’adhérer aux lamelles.

Laisser les cellules trop longtemps à 37 degrés entraînera une division cellulaire et une dilution des plasmides transfectés. Les cellules transfectées doivent être ensemencées à une densité suffisamment faible pour qu'elles soient isolées les unes des autres, comme illustré ici. Cela facilitera l'enregistrement électrophysiologique.

Pour les cellules nécessitant des sous-unités accessoires, il est souvent nécessaire de transférer les cellules à 28 degrés Celsius et de les incuber pendant trois à quatre jours supplémentaires avant l’enregistrement électrophysiologique. L’enregistrement est effectué sur les cellules qui ne nécessitent pas de sous-unités accessoires. Cet enregistrement peut être réalisé immédiatement après cette période d’incubation.

L'appareil d'électrophysiologie utilisé ici comprend un amplificateur, des manipulateurs de micropipettes motorisés doubles et un microscope à fluorescence épiscopique, ainsi que des systèmes de perfusion. L'équipement est installé sur une table d'isolation vibratoire et à l'abri des interférences électriques. Les bruits électriques parasites sont limités par une cage de Faraday de type 2 haute de 40 pouces. Les systèmes de commande électroniques comprennent un ordinateur équipé d'une interface Digit Data 1440, un convertisseur analogique-numérique, utilisés conjointement avec le logiciel P-Clamp 10.1.

L'amplificateur du moniteur d'ordinateur, le manipulateur motorisé et un système de contrôle de perfusion par commande de valve sont tous montés à l'extérieur de la cage de Faraday. Sur un bâti électrique métallique autonome de 19 pouces, tous les équipements électriques sont reliés à la terre via un distributeur en cuivre et branchés sur un transformateur d'isolation de qualité médicale, qui assure l'isolation de la ligne, une mise à la terre constante et la suppression des surtensions. Pour préparer les expériences, monter des micropipettes à embouts polis au feu, ayant une résistance de deux à cinq mégohms, sur le porte-micropipette fixé sur le porte-électrode.

Les pipettes de patch sont remplies avec la solution interne, secouées brièvement pour éliminer les bulles d'air, puis montées sur le porte-pipette. Ensuite, à l’aide de pinces, transférez une lame couvre-objet portant des cellules cultivées dans une boîte de Petri en plastique de 35 millimètres contenant trois millilitres de solution externe d’enregistrement à température ambiante. Le volume de la solution d’enregistrement doit être mesuré avec précision lors d’expériences pharmacologiques au cours desquelles des quantités connues de médicament sont ajoutées dans la boîte à l’aide d’une micropipette ; placez ensuite la boîte sur la platine du microscope.

Ensuite, remplissez une demi-cellule du porte-électrode micro avec du chlorure de césium à trois molaire. Insérez ensuite l'électrode de référence dans la demi-cellule et placez l'électrode de masse dans le bain à l’aide du micromanipulateur, puis abaissez la pipette de patch dans la solution du bain. Visualisez les cellules en mode fluorescence et centrez une cellule adhérente verte isolée, positivement transfectée, au milieu du champ de vision.

En mode bain, approchez la micropipette de la cellule jusqu'à ce qu'elle soit très proche. Réglez à zéro la trace d'onde carrée observée sur l'écran de l'ordinateur. Ajustez la position de la micropipette afin qu'elle touche légèrement la cellule et que la trace de courant carré à l'écran commence à fluctuer.

Appliquer une aspiration douce à l’aide d’une seringue fixée jusqu’à la formation d’un scellement gigaohm. Une fois le scellement gigaohm obtenu, passer le programme en mode patch. Appliquer une impulsion rapide d’aspiration avec la seringue afin de percer la membrane cellulaire.

Ensuite, passez en mode cellule entière et utilisez les paramètres de cellule entière sur l'amplificateur. Pour compenser le transitoire capacitif, il est nécessaire d'équilibrer le patch afin que la solution d'enregistrement intracellulaire diffuse dans la cellule patchée. Saisissez ici les protocoles de blocage de tension rédigés pour cette expérience.

L'expérimentateur a conçu un protocole permettant de mesurer les courants ioniques traversant les canaux ioniques activés par la tension lorsque la tension à travers la membrane cellulaire est modulée. Dans ce cas, nous examinons un protocole IV qui précise que le logiciel doit maintenir la cellule à moins 110 millivolts, puis effectuer une étape jusqu'à moins 70 millivolts pendant 250 millisecondes. Ensuite, retour à moins 110 millivolts, potentiel de maintien, chaque fois que l'étape augmente de 10 millivolts, de sorte que les étapes successives soient de moins 70 millivolts, moins 60 millivolts, etc., jusqu'à la dernière étape qui atteint plus 20 millivolts.

Filtrez les courants enregistrés à 10 kilohertz à l’aide d’un filtre passe-bas de Bessel sur l’amplificateur et numérisez-les à une fréquence d’échantillonnage de deux kilohertz à l’aide du logiciel Clamp X 10.1. N’utilisez que les enregistrements présentant une fuite minimale inférieure à 10 %. Pour l’analyse, des cellules HEK 293T ont été cultivées et transfectées avec les canaux calciques L Cav. Trois canaux calciques comme indiqué ici. La réussite du transfection des ADNc d’ions canaux hétérologues a été indiquée par la fluorescence générée à partir du vecteur P-I-R-E-S deux eeg FP.

Ici, nous démontrons une expression réussie d'un canal calcique voltage-dépendant de type cav trois d'invertébré. En l'absence de transfection, aucune courant calcique ne peut être déclenché. En revanche, les cellules transfectées génèrent de forts courants lorsque des protocoles de blocage voltage en configuration tout-enregistrement sont appliqués aux cellules.

Les expérimentateurs peuvent utiliser diverses conditions électrophysiologiques et régimes d'analyse des données selon leurs besoins. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir d'appliquer son propre jugement concernant le moment des expériences. Étant donné que différents canaux s'expriment avec des efficacités variables au niveau de la membrane cellulaire, il vous appartient de déterminer la stratégie optimale permettant d'augmenter la viabilité des cellules ainsi que de maximiser l'expression membranaire des canaux qui vous intéressent.

Après avoir visionné cette vidéo, nous espérons que vous avez acquis une bonne compréhension de la culture et de la maintenance d'une lignée cellulaire humaine, ainsi que de la transfection de CDNAs d'ions canaux hétérologues et de CDNAs de sous-unités dans ces cellules. Pour l'enregistrement électrophysiologique.