Isolement du cerveau et les cellules mononucléées de la moelle épinière utilisant gradients de Percoll

Les cellules immunitaires pénètrent dans le système nerveux central lors d'une infection, d'un traumatisme, d'une maladie auto-immune ou d'une neurodégénérescence. Bien que les approches histochimiques permettent de déterminer la localisation des cellules infiltrantes et d'analyser la pathologie associée, ces techniques sont limitées par le nombre d'anticorps pouvant être utilisés simultanément. Une méthode de purification rapide de cellules mononucléées à partir de tissus cérébraux et médullaires est décrite ici, dans laquelle le tissu disséqué est d'abord homogénéisé.

Ensuite, un gradient de Percoll est mis en place et, après centrifugation, les cellules mononucléées sont récupérées à l'interface. Enfin, les cellules sont lavées et marquées par des anticorps. Par analyse en cytométrie en flux, les cellules d'origine hématogène et les microglies de surveillance sont distinguées, et leurs proportions relatives au cours des états pathologiques peuvent être déterminées. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que le gradient Aris ou l'histochimie, est qu'elle est moins longue.

Cela vous permet de traiter plus de tissus simultanément. Palino A, une technicienne de mon laboratoire, va démontrer la mise en place du gradient. Préparez les réactifs nécessaires pour ce protocole. Commencez avec quatre millilitres de Percoll isotonique stock, appelé SIP, par cerveau.

Pour ce faire, mélangez neuf parts de perol avec une part de HBSS 10× sans calcium ni magnésium en retournant le tube. Ensuite, préparez 70 % de per call en mélangeant le SIP préparé avec du HBSS 1× sans calcium ni magnésium. Puis, distribuez deux millilitres de la solution à 70 % de per cole dans un tube conique polypropylène de 15 millilitres pour recueillir le tissu.

Pour cette procédure, placer les cerveaux et moelles épinières disséqués de tous les souris d'étude dans des béchers contenant 10 millilitres de RPMI sur de la glace. Ensuite, transférer le tissu dans un homogénéisateur descendant de 7 ou 15 millilitres contenant 3 millilitres d'HBSS 1x avec un piston ajusté lâche. Homogénéiser délicatement pour obtenir une suspension cellulaire, puis passer à un piston de taille B ajusté étroitement, et poursuivre la dissociation des tissus.

Une fois le tissu homogénéisé, ajouter du RPMI ou du HBSS 1x jusqu'à un volume final de sept millilitres, puis procéder à la préparation du gradient pour établir le gradient de percoco. Commencer par ajouter trois millilitres de SIP à la suspension cellulaire afin d'obtenir une concentration finale de PERCOCO de 30 %. Veiller à ce que le perol soit utilisé à température ambiante. S'il est utilisé froid, les cellules ont tendance à s'agglutiner et la séparation cellulaire est moins efficace.

Ensuite, à l’aide de notre pipette munie d’un système de réglage en mode gravité, déposez lentement la suspension cellulaire de 10 millilitres au-dessus du SIP à 70 %. Évitez de mélanger les solutions à 70 % et à 30 %. Cette étape constitue la phase la plus critique du protocole.

Une ligne plate très nette doit être visible au niveau de la jonction entre 70 et 30 %. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés, car les solutions à 3 % et à 70 % se mélangent lors de la superposition. Étape suivante, compromettant l'interface : centrifuger pendant 30 minutes à 500 G à 18 degrés Celsius.

Veillez à ce que la centrifugeuse s'arrête avec un freinage minimal ou nul afin de ne pas perturber l'interface. Après la centrifugation des gradients, une couche épaisse et visqueuse de débris doit s'accumuler au sommet du tube. La couche suivante est la couche jaunâtre de 30 % de per core, qui contient parfois des débris.

Viens ensuite l'interface 70 à 30, qui doit présenter un halo blanc bien défini et contient les cellules mononucléées. Enfin, au fond du tube, se trouve la couche claire de Percoll à 70 %. Si aucune interface n'est observée, le rendement en cellules sera probablement très faible, rendant toute analyse ultérieure extrêmement difficile.

Par conséquent, à ce stade, des suspensions cellulaires fraîches peuvent être nécessaires pour réduire la contamination. Retirez soigneusement la couche de débris située au sommet du tube et jetez-la. Ensuite, à l’aide d’une pipette en plastique, traversez les 30 % supérieurs de la couche centrale et récupérez deux à trois millilitres de l’interphase 70-30, puis transférez-les dans un tube conique propre contenant huit millilitres d’HBSS à une fois.

Mélangez plusieurs fois les interfaces diluées par retournement, puis centrifugez pendant sept minutes à 500 ×g à 18 degrés Celsius. Après la centrifugation, retirez le surnageant et remettez en suspension le culot. Dans un millilitre de tampon de marquage des cellules, transférez la suspension cellulaire dans un tube de 1,5 millilitre et lavez-la encore une fois.

Utilisez une microcentrifugeuse à 10 000 ×g pendant une minute à quatre degrés Celsius avant de procéder à la coloration par anticorps ; resuspendez les culots dans 50 microlitres d'anticorps purifié anti-US CD 16, CD 32, dilué au 1/200 dans un tampon de coloration cellulaire afin de bloquer les sites de fixation FC. Comme pour toute procédure de coloration, il est impératif que tous les anticorps soient correctement titrés ; incubez sur glace pendant 10 minutes. Pendant l'incubation, prélèvez deux à cinq microlitres de cellules et comptez-les à l'aide d'un hémocytomètre.

Les tissus combinés de cerveau et de moelle épinière naïfs devraient fournir environ trois à cinq fois dix puissance cinq cellules par souris. Les cerveaux enflammés contiendront un nombre variable de cellules inflammatoires selon le point temporel de prélèvement et le modèle de maladie. Après l'incubation avec CD 16 et CD 32, ajouter 50 microlitres de mélange d'anticorps spécifiques des cellules immunitaires. Le mélange utilisé dans cet exemple contient des anticorps dirigés contre CD 45, CD 4 et CD 19 ; incuber sur glace pendant 30 minutes.

Il est important de titrer chaque anticorps au préalable. Pour déterminer la dilution optimale, utilisez des combinaisons de fluorochromes adaptées en fonction des capacités des lasers et des réglages de filtres de votre cytomètre en flux particulier. Après avoir marqué les cellules, les laver dans le tampon de marquage des cellules en ajoutant un millilitre de tampon de marquage des cellules et en les centrifugeant pendant une minute.

À 10 000 ×g après la centrifugation, éliminer le surnageant, puis resuspendre les culots dans 100 à 200 microlitres de tampon de marquage cellulaire pour une analyse cytométrique en flux immédiate ou ultérieure. Resuspendre ensuite les cellules dans du paraformaldéhyde à 2 % préparé dans du PBS et conserver une nuit à quatre degrés Celsius. On observe ici des cellules mononucléées obtenues et incubées avec un blocant FC, suivies d'anticorps anti-CD45, anti-CD4 et anti-CD19.

Conformément au protocole démontré par cytométrie en flux, la coloration CD45 sépare nettement les cellules hématogènes CD45 élevées des microglies de surveillance CD45 faible intensité (DIM). Cette figure compare les cellules isolées à partir d’un cerveau naïf et d’un cerveau enflammé chez une souris induite à développer une encéphalomyélite auto-immune expérimentale. L’intensité du CD45 APC est indiquée sur l’axe des ordonnées, où trois populations distinctes sont visualisées dans le cerveau naïf.

Très peu de cellules CD45 de forte expression sont détectées. Généralement moins de 2 % de la population totale isolée. En comparaison, les cerveaux de souris atteintes de la maladie EAE montrent un afflux massif de cellules sanguines recrutées vers le cerveau.

L'ajout d'autres marqueurs de surface cellulaire, tels que CD11b, CD4, CD8, etc., permet une caractérisation plus poussée de la population CD45 élevée. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre heures si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que les approches histologiques, combinées au phénotypage immunitaire par cytométrie en flux, sont essentielles pour caractériser pleinement la composition des infiltrats inflammatoires du SNC.