Les peptides de la bibliothèque de Phage Display modulent l'expression génétique dans les cellules mésenchymateuses et potentialiser l'ostéogenèse dans des défauts osseux Unicortical

L'objectif général de cette expérience est d'identifier des séquences qui potentialisent la différenciation des cellules mésenchymateuses et favorisent la réparation osseuse. La première étape consiste à isoler par biopanning le bactériophage qui se lie à l'os. Ensuite, identifier les séquences peptidiques qui se lient aux cellules mésenchymateuses et déterminer également les modifications ultérieures de l'expression génique.

Réalisez des expériences afin de déterminer comment les séquences peptidiques peuvent être acheminées vers l'os à des fins régénératives. Dans une dernière étape, examinez histologiquement la réparation osseuse ; pris ensemble, les résultats peuvent fournir des informations importantes sur les mécanismes de différenciation cellulaire in vitro et de réparation osseuse in vivo. Les avantages de l'utilisation de la technique de biopanning avec une bibliothèque d'affichage sur phage sont qu'elle nous a permis d'identifier des peptides ciblant l'os et pouvant être utilisés pour stimuler la différenciation des cellules mésenchymateuses et potentialiser la réparation osseuse.

En fin de compte, ces séquences peptidiques pourraient s'avérer utiles dans des modalités thérapeutiques destinées à la réparation osseuse et au traitement de la perte osseuse, comme l'ostéopénie et l'ostéoporose. Sur la base d'une étude dans laquelle ULA et Pascal ont montré que le biopanning peut être utilisé pour isoler des séquences peptidiques ciblant les vaisseaux sanguins, nous avons choisi d'adapter cette méthode afin d'explorer les mécanismes osseux. Pour la procédure de biopanning in vivo, nous avons perfusé 10 fois 10 à la puissance 10 unités formant des plaques de la bibliothèque d'affichage peptidique N-E-B-P-H-D 12 à travers le cœur d'une souris valve C âgée de 10 semaines.

Après environ cinq minutes, euthanasier la souris, exposer et disséquer les fémurs, couper les extrémités et extraire la moelle osseuse. Rincer le fémur gauche à l'intérieur et à l'extérieur avec du PBS 10 fois. Puis ajouter l'os aux bactéries ER 2 5 3 7.

Afin d'éliminer les phages non liés, utilisez 2 % de lait écrémé en poudre dans une seringue munie d'une aiguille de calibre 21 pour rincer 10 fois le canal intermédiaire du fémur droit. Éluisez ensuite les phages liés du canal intermédiaire à l'aide d'un tampon glycine-acide chlorhydrique, pH 2,2, neutralisé avec une mole de triss.

Pour amplifier le phage, ajouter du EIT aux bactéries ER 2 5 3 7 et cultiver pendant 4,5 heures. Transférer soigneusement les surnageants dans des tubes frais et précipiter le phage trois fois par ajout de polyéthylène glycol. Solution de chlorure de sodium, incuber les tubes toute la nuit à quatre degrés Celsius.

Enfin, resuspendre le culot dans du TBS contenant 0,02 % d'azoture de sodium. Plaquer le bactériophage sur des boîtes de culture pour déterminer les unités formant des plaques des EIT amplifiés. Répéter la procédure de bio-pannage in vivo quatre fois pour les bactériophages éludés et non éludés.

Amplifiez les phages groupés dans des cultures bactériennes. Purifiez et quantifiez la séquence d'ADN, l'ADN phagique final, en utilisant l'amorce 98 fournie avec le kit de phagie. Importamment, calculez la fréquence de représentation de la séquence d'ADN phagique.

Synthétisez maintenant des peptides incorporant une séquence graine de glycine-glycine-glycine-lysine et amplifiez les cellules D1, une lignée clonée de cellules souches mésenchymateuses multipotentes de moelle osseuse de souris développée dans notre laboratoire à une confluence de 90 %. Traitez les cellules à la trypsine, centrifugez-les pour former un culot, comptez-les, puis semez-les sur des lamelles à puits revêtues de gélatine pour la coloration aux peptides, et cultivez-les pendant 24 heures.

Lavez les cellules avec du PBS et fixez-les avec du paraformaldéhyde 4 % pendant 30 minutes. Effectuez maintenant des incubations de blocage avec de la glycine, suivies de BSA Aden et de BBSA. Solutions de blocage à la biotine.

Ajouter 100 micromolaire de peptides biotinylés L sept et R un. Procéder au lavage des cellules trois fois avec du PBS pendant cinq minutes chacun. Ajouter une dilution au 1/1000 du réactif LOR strippin, couvrir et protéger de la lumière, puis incuber dans un tiroir sombre pendant 30 minutes.

Lavez les cellules et montez les lamelles avec le milieu de montage Vector Shield. Analysez ensuite les lames au microscope à fluorescence 24 heures avant la chirurgie. Imbibez les cylindres de gel mousse.

Transférez les cylindres de mousse de gel contenant le peptide à 20 micromolaire, soit L sept, soit R un, soit du tampon PBS sans peptide, dans des plaques de culture stériles à 12 puits et réfrigérez toute la nuit à quatre degrés Celsius au moment de la chirurgie. Placez le composite de mousse de gel sur de la glace jusqu'à son utilisation.

À l’aide d’un foret pneumatique sous irrigation saline, créez un large défaut unicoertical oblong de trois millimètres de largeur sur huit millimètres de longueur. Traitez le défaut osseux avec des éponges gélifiées préparées en insérant délicatement toutes les échafaudages implantés par de légers tapotements. Euthanasiez les rats et prélèvez les tibias à des points temporels définis ; vérifiez attentivement la présence du défaut osseux et fixez les tibias récoltés dans du formol tamponné neutre à 10 % pour l’incorporation en paraffine.

Enfin, colorer toutes les coupes de tissu à l'hématéine-éosine afin de marquer la matrice ostéo. L'adénine marquée par l'isothiocyanate de fluorescéine permet la détection microscopique de la liaison des peptides sur des cellules cultivées in vitro. Ici, les peptides se lient aux cellules mésenchymateuses en culture afin de déterminer l'effet ostéogénique des peptides sur les cellules.

Des cellules mésenchymateuses cultivées in vitro peuvent être traitées avec des peptides test afin de déterminer les modifications de la morphologie cellulaire. Par exemple, au quatrième jour, les cellules commencent à s'agréger et les agrégats s'agrandissent au fil du temps pour former des nodules. Fait intéressant, une coupe osseuse colorée à l'hématoxyline et à l'éosine présente une autofluorescence sous lumière UV.

Ce contraste accru entre les tissus osseux et non osseux facilite les analyses permettant de quantifier la présence d'os dans les coupes afin de déterminer la réparation osseuse dans les défauts traités au gelfoam associé à un peptide. Par comparaison avec le gelfoam seul, les défauts remplis avec le peptide ont montré la plus grande quantité de réparation corticale au fil du temps. Lors de la réalisation de cette procédure, il est essentiel d'être extrêmement méthodique dans la saisie des données en raison du grand nombre d'échantillons qui s'accumuleront inévitablement avant de sélectionner le groupe final de peptides.

Le développement du biopanning in vivo en tant que technique permettant d'identifier des peptides ciblant l'os signifie que nous disposons désormais de médicaments potentiels pouvant être utilisés comme traitement pour la réparation osseuse et la perte osseuse. L'un des mécanismes qui sous-tend la réparation osseuse est également impliqué dans la perte osseuse. Comprendre ces mécanismes plus en détail et disposer d'outils pouvant être utilisés pour le traitement de troubles tels que les fractures retardées et l'ostéoporose permettra d'améliorer les thérapies pouvant être conçues pour les soins de santé.