La cryoconservation de tissu cortical Blocs pour la génération des cultures de neurones hautement enrichi

Bonjour, je m'appelle Alan et je travaille dans le laboratoire du Dr Horney Lu à l'Université de Californie à Irvine, au sein du Département de neurobiologie et de comportement. Et moi, c'est Bob. Aujourd'hui, le Dr Haro va vous présenter un protocole rapide, efficace et fiable pour la cryoconservation routinière de blocs de tissu cortical, en vue de l'obtention ultérieure de cultures primaires de neurones de haute qualité.

Commençons donc. Le tissu nettoyé et haché est chargé dans des cryotubes contenant un milieu de congélation à 10 % de TMSO.

Les cryotubes sont chargés dans un conteneur de congélation puis placés à moins 80 degrés Celsius pendant au moins quatre heures. Les cryotubes congelés sont ensuite placés dans de l'azote liquide pour une conservation à long terme. Pour la culture, le cryotube AC est décongelé dans un bain d'eau tiède et rincé avec du HBSS tiède afin d'éliminer le DMSO résiduel.

Un HBSS frais est ajouté avec de la trypsine pour la dissociation, puis du DMM contenant 10 % de SBE est ajouté. Pour arrêter l'activité enzymatique dissociative, les cellules sont centrifugées et le culot est resuspendu dans du DMM frais supplémenté de 10 % de SBE, puis ensemencé dans des boîtes pré-enduites de polylysine. Après 24 heures, le DMM est remplacé par un milieu neurobasal enrichi et les cellules sont cultivées pendant 10 jours.

Ce protocole utilise une lame de rasoir en acier pour découper le tissu cortical avant utilisation. La lame doit être stérilisée dans de l'éthanol à 70 % pendant au moins deux heures. Une solution saline tamponnée au Hank (HBSS) à 1 x est préparée en diluant une solution mère 10 x dans de l'eau stérilisée ; la solution HBSS à 1 x est ensuite conservée sur de la glace ou à quatre degrés Celsius jusqu'au traitement du tissu.

L'oxyde de diméthylsulfure ou DMSO est utilisé comme agent cryoprotecteur dans le milieu de congélation. Ce protocole utilise une dilution volumétrique de 10 % de DMSO dans un volume d'H-B-S-S-D-M-S-O ; le mélange doit être complet avant stockage à quatre degrés Celsius. Un contenant de congélation Nalgene est utilisé pour contrôler la vitesse de congélation des échantillons.

Le conteneur de congélation est chargé avec des cryotubes de 2,5 millilitres préalablement étiquetés. Il est également conseillé d'étiqueter les conteneurs de congélation eux-mêmes si vous en utilisez plusieurs, et de noter le conteneur correspondant sur la bile. Le milieu de congélation contenant 10 % de DMSO, préalablement refroidi, ainsi que le conteneur de congélation, sont introduits dans une cabine de sécurité biologique stérile.

Ici, un millilitre de milieu de congélation est lentement ajouté à chacun des cryotubes. Après s'être assuré que les bouchons sont bien fermés, placer le contenant de congélation avec les tubes à quatre degrés Celsius pendant au moins deux heures, juste avant le traitement du tissu. La lame de rasoir préalablement stérilisée doit être rincée soigneusement. Trois lavages de trois minutes chacun.

L'utilisation d'eau stérilisée devrait suffire à éliminer tout éthanol résiduel. Cette procédure de lavage doit être rapide, car le rasoir est sujet à l'oxydation en cas d'immersion prolongée dans l'eau stérile. Avant le nettoyage, le tissu doit être placé sur une poche de glace.

Rincez légèrement à l’eau froide X-H-B-S-S pour éliminer tous les débris libres. Des aiguilles stérilisées sont utilisées pour nettoyer les fragments de tissu de toute membrane ou vaisseau sanguin résiduel. Il est essentiel de préserver l’intégrité structurelle du tissu pendant le nettoyage.

À mesure que cela augmentera, l'efficacité de la découpe du tissu propre sera visiblement différente de celle du tissu brut et devrait présenter la majorité des membranes ou des vaisseaux sanguins retirés. Une fois le tissu nettoyé et rincé, la découpe peut commencer. Il est important d'effectuer des incisions nettes du tissu afin de former des blocs d'environ un millimètre cube de taille.

Des blocs trop gros entraînent un rendement cellulaire plus faible au dégel. Les blocs plus petits, toutefois, doivent également éviter une surtransformation. Les tissus hachés peuvent être recueillis à l’aide d’une pipette automatique et d’un peu de milieu X-H-B-S-S frais.

Veillez à rincer la boîte avec du HBSS afin de récupérer tous les tissus collectés. Le tissu est ensuite ajouté à un grand volume de HBSS 1X et laissé tomber au fond, formant un culot lâche. Cela permet d'éliminer tous les débris résiduels présents pendant que le tissu sédimente dans le HBSS. Récupérez le récipient de congélation préalablement refroidi et les cryotubes avant de répartir le tissu.

Veillez à retirer les bouchons de tous les flacons afin d'accélérer le processus de remplissage des échantillons de tissu. L'exposition au DMSO à température ambiante ne doit pas dépasser 10 minutes. Il est conseillé de travailler avec un seul contenant de congélation à la fois, jusqu'à ce que tout le tissu soit utilisé.

Commencez par aspirer le surnageant d'un tissu lâche, en vous rapprochant au maximum du culot sans le perturber. Ensuite, fixez une pointe de 200 microlitres à orifice large sur une pipette. N'utilisez pas de pointe à orifice plus petit, car cela compromettrait la structure des blocs qui se déposent au fond du culot de tissu.

Prélvez 200 microlitres de tissu lentement. Ajoutez ce tissu à un tube cryogénique et passez au suivant jusqu'à ce que tous les tubes soient remplis. Une règle de 10 minutes pourrait être nécessaire.

Placer rapidement le conteneur de congélation dans des cryotubes et entreposer ceux-ci dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius pendant au moins quatre heures, ou toute la nuit si le temps est limité. Après un temps suffisant, retirer le conteneur de congélation du congélateur et répartir les cryotubes dans une boîte cryogénique aussi rapidement que possible. Placer la boîte cryogénique dans un support de boîte à azote liquide pour un stockage à long terme.

Retirer une ampoule cryogénique de l'azote liquide le plus rapidement possible, en limitant l'exposition des boîtes cryogéniques à la température ambiante, puis faire fondre rapidement l'échantillon en l'immergeant dans un bain d'eau à 37 degrés Celsius. Garder toujours le bouchon au-dessus du niveau de l'eau. Vérifier fréquemment et poursuivre le décongélation jusqu'à l'observation d'un petit morceau de glace.

Avant de l'apporter dans l'enceinte de sécurité, stérilisez le flacon cryogénique avec de l'éthanol à 70 %. Procédez ensuite à l'ajout du tissu décongelé dans un grand volume de HBSS tiède à une fois, si du tissu reste sur les parois du flacon cryogénique. Récupérez délicatement avec du HBSS.

Une fois que tous les tissus ont été collectés, retournez le tube trois à quatre fois et laissez le tissu se déposer au fond. Cette étape garantit une dilution suffisante du DMSO.

Une fois le tissu déposé, aspirez autant que possible le surnageant. Ajoutez ensuite 10 millilitres de H-B-S-S frais et chaud à 1 X. Ajoutez 300 microlitres de trypsine à 0,25 % et 50 microlitres d'ADN.

Procéder à la dissociation du tissu par agitation douce, afin d'obtenir une suspension cellulaire trouble une fois le tissu dissocié. Arrêter l'activité enzymatique en ajoutant du DM chaud plus 10 % de sérum bovin enrichi EPS, puis centrifuger les suspensions cellulaires à 1200 ×g pendant cinq minutes. Resuspendre le culot cellulaire dans du DMEM frais plus 10 % de SBE et ensemencer sur des plaques revêtues de polylysine.

Laisser les cellules s’attacher aux boîtes pendant 30 minutes. Ensuite, remplacer le milieu par du DM frais additionné de 10 % de SBE. Après 24 heures, remplacer le milieu contenant du DM par un milieu neurobasal supplémenté avec N deux et B 27, puis faire croître pendant 10 jours.

Nous venons de détailler un protocole vaste, efficace et fiable associé à une cryopréservation de routine de blocs de tissu cortical. Bonne chance.