Isolement mitochondriale du muscle squelettique

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des mitochondries et de mesurer la respiration mitochondriale. Cette opération s'effectue tout d'abord en isolant le muscle squelettique de rats spray dly. Ensuite, le muscle est homogénéisé et les mitochondries sont isolées par centrifugation.

La concentration en protéines est ensuite déterminée à l'aide du test de Bradford. Enfin, la respiration mitochondriale est mesurée par polygraphie. En définitive, des résultats peuvent être obtenus qui montrent la consommation d'oxygène au cours des différents états de la respiration mitochondriale.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du muscle squelettique, telles que l'effet de différentes interventions sur la fonction mitochondriale. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le métabolisme du muscle squelettique, elle peut également être appliquée à d'autres organes tels que le foie, le cerveau, le rein ou presque n'importe quel tissu avant le début de la procédure. Pour isoler le muscle squelettique, préparez les solutions suivantes : P-B-S-P-B-S plus 10 millimolaire de EDTA, huit fois le tampon d'isolement des mitochondries, tampon d'isolement un ou IB un, tampon d'isolement deux ou IB deux et tampon expérimental ou eb.

Voir le protocole écrit accompagnant pour les instructions. Ensuite, allumez la centrifugeuse et réglez-la à quatre degrés Celsius. Allumez un bain-marie et réglez-le à 37 degrés Celsius.

Dans un bon seau, placez trois béchers de 10 millilitres, un broyeur à tissus gem, de petites ciseaux chirurgicaux et 10 tubes de microcentrifugation sur de la glace. Tout doit rester glacé pendant toute la durée de l'expérience. Placez IB un et IB deux sur de la GLACE et EB dans un bain-marie tiède.

Ensuite, ajoutez les solutions suivantes aux trois béchers placés sur de la glace : bécher un, 10 millilitres de PBS ; bécher deux, 10 millilitres de P-B-S-E-D-T-A ; bécher trois, trois millilitres d'ib. Un, euthanasiez un rat conformément aux procédures approuvées par le comité local de soins aux animaux de votre institution.

Ensuite, isoler rapidement 250 à 500 milligrammes de muscle squelettique à l’aide de pinces et de ciseaux Mayo Clinic. Le rincer dans le bécher un, puis le transférer dans le bécher deux, afin d’homogénéiser le muscle. Tout d’abord, le transférer dans le bécher trois, puis finalement le hacher finement avec les ciseaux.

Transférez la solution dans l'homogénéisateur Potter-Elvehjem et homogénéisez le muscle à l’aide d’un pilon motorisé 10 fois, en gardant le tube sur de la glace en tout temps. Ensuite, transférez l’homogénat dans des tubes microcentrifugeurs prérefroidis de deux millilitres et centrifugez à 700 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Transférez le surnageant S dans un nouveau tube microcentrifugeur prérefroidi et jetez le culot centrifugé.

Le surnageant S à 10 500 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, transférez le SNAT dans un nouveau tube de microcentrifugeuse prérempli et étiquetez-le avec SN un et type de muscle Reese. Suspendez le culot dans 500 microlitres de IB deux, puis centrifugez à 10 500 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Transférez le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugeuse prérempli et étiquetez-le avec SN deux et type de muscle.

Suspendez le culot mitochondrial final dans 100 microlitres de IB deux. Faites-le centrifuger brièvement dans une microcentrifugeuse. S'il y a un culot, transférez le surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge pré-rempli et jetez le culot. L'étalonnage de l'électrode à oxygène est une étape clé de ce protocole et doit être effectué quotidiennement.

Étalonnage de l'électrode peut être effectué pendant l'isolement mitochondrial. Pour commencer, ajouter 100 millilitres d'eau distillée dans un ballon de 250 millilitres et agiter vigoureusement pendant 20 minutes. Pour équilibrer l'eau avec le gaz atmosphérique, recouvrir l'électrode GRAT de quelques gouttes de chlorure de potassium à 50 %.

Placez ensuite un petit morceau de papier à rouler bleu Rizla sur l'électrode. Puis un morceau de membrane en PTFE par-dessus le papier à rouler.

Appliquez l'anneau intérieur à l'aide de l'appliquateur d'anneau, puis placez l'anneau extérieur dans la rainure de l'électrode. Connectez les électrodes et assemblez la base en plastique plus grande, la chambre mitochondriale et les tuyaux d'eau. Allumez les boîtiers GRAT et démarrez le logiciel GRAS.

Ajouter l'eau équilibrée à la chambre mitochondriale. Puis ajouter un barreau d'agitation pour activer l'agitation. Cliquer sur le matériel.

Ensuite, remuez à une vitesse. Réglez la vitesse sur 60 et cliquez sur. Ensuite, commencez une nouvelle expérience.

Cliquez sur étalonner, puis sur étalonnage en phase liquide. Pour la boîte un, modifiez la température à 37 degrés Celsius et cliquez deux fois sur OK. Lorsque la modification par défaut passe à OK, cliquez dessus et ouvrez le réservoir de gaz azote.

Placer l'embout raccordé au réservoir d'azote dans la chambre et établir une concentration nulle en oxygène. Cliquer sur OK lorsque le passage au mode de secours est terminé. Aspirer l'eau et ajouter 500 microlitres de EB dans les chambres mitochondriales.

Scellez la chambre avec un piston. Si vous utilisez plusieurs boîtes, répétez à partir de l'étape d'étalonnage pour chaque boîte. Démarrez une nouvelle expérience et laissez-la fonctionner environ une minute.

Pour stabiliser le signal, ajouter le volume nécessaire de la suspension de mitochondries afin d'obtenir 150 microgrammes dans chaque chambre. Marquer l'événement et laisser fonctionner. Pendant une minute, ajouter 10 microlitres de glutamate à 250 millimolaire et de malate à 125 millimolaire, préchauffés, pour obtenir une concentration finale de cinq millimolaire en glutamate et de 2,5 millimolaire en malate, marquer cet ajout, puis laisser fonctionner pendant une minute.

Ceci est défini comme l'état deux. Ensuite, ajoutez 7,5 µL de DP à 10 millimolaire pour une concentration finale de 150 µmol/L. Puis marquez et laissez fonctionner pendant 30 secondes.

Ceci est défini comme l'état trois. Ajouter encore 7,5 µL de DP 10 mmol·L⁻¹, et laisser tourner pendant 1,5 minute. Ajouter 0,5 µL d'oligomycine froide 10 mmol·L⁻¹ pour une concentration finale de 1 µmol·L⁻¹, et laisser tourner pendant trois minutes.

Cet état est défini comme l'état quatre. Ajouter un microlitre de FCCP froid à 0,1 millimolaire pour obtenir une concentration finale de 0,2 micromolaire, puis laisser la RUM pendant trois minutes. Cet état est défini comme l'état cinq.

Lorsque l'expérience est terminée, mettez fin à celle-ci et enregistrez-la. Acquérez les taux de respiration à l'aide du logiciel raft. Saisissez le facteur de normalisation.

Si vous ajoutez 150 microgrammes de protéine mitochondriale, le facteur de normalisation sera de 0,15. Calculez les taux de respiration normalisés pour les différents états respiratoires. Calculez le rapport de contrôle respiratoire, ou RCR, en divisant l'état trois par l'état quatre.

Cette figure montre un tracé représentatif de la consommation d'oxygène par le muscle squelettique.Mitochondries. Une fois que le signal de l'électrode est stabilisé, l'échantillon de mitochondries est ajouté à la chambre GRAT. La respiration à l'état deux démarre par l'ajout de glutamate et de malate.

L'ajout d'ADP augmente la consommation d'oxygène. Définition de l'état trois. La respiration est bloquée par l'ajout de l'oligomycine pour obtenir la respiration à l'état quatre.

Enfin, le FCCP est ajouté pour découpler la respiration mitochondriale. Ce diagramme montre les taux représentatifs de consommation d'oxygène pour les états 2, 3, 4 et cinq. Le rapport de contrôle respiratoire, ou RCR, est calculé pour chaque expérience.

Un RCR supérieur à quatre est considéré comme une preuve d'une préparation de mitochondries viable. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de maintenir les échantillons de mitochondries sur de la glace en tout temps. Après avoir suivi cette procédure.

D'autres méthodes, telles que les immunotransferts (Western blots), peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la teneur en protéines mitochondriales. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler des mitochondries à partir de muscle squelettique ainsi que la respiration mitochondriale.