Quantification des ADNdb utilisant le Hitachi F-7000 Spectrophotomètre de fluorescence et de PicoGreen Dye
5 novembre 2010
Démonstration de la quantification des ADN double brin à l'aide Molecular Probes PicoGreen colorant et spectrophotomètre Hitachi fluorescence F-7000 équipé d'un accessoire lecteur de microplaques.
L'objectif général de cette procédure est de démontrer la capacité du spectrophotomètre de fluorescence F 7,000 équipé d'un lecteur de microplaques à quantifier l'ADN double brin à l'aide du colorant Pico green. Cela est réalisé en préparant tout d'abord les échantillons et les réactifs. La deuxième étape de la procédure consiste à configurer l'instrument.
La troisième étape de la procédure consiste à charger les échantillons dans le lecteur de microplaques. La dernière étape de la procédure est la mesure des étalons et des échantillons. En fin de compte, on peut obtenir des résultats montrant une courbe d'étalonnage linéaire, qui pourrait être utilisée pour la quantification de l'ADN double brin d'échantillons inconnus.
Activez le fluorimètre Hitachi F 7,000 pour permettre à la lampe au xénon de chauffer pendant une heure dans Excel. Créez un fichier contenant les données des étalons et de l'échantillon, puis enregistrez-le au format de valeurs séparées par des virgules (CSV). Pour configurer le fluorimètre, cliquez d'abord sur le bouton « méthode », ce qui ouvre la fenêtre de méthode d'analyse.
Dans le champ de mesure, sélectionnez la photométrie dans le menu déroulant. Cliquez maintenant sur l'onglet de quantification. Dans le champ de type de quantification, sélectionnez longueur d'onde pour indiquer que la lecture de fluorescence sera effectuée à l'aide d'une longueur d'onde spécifiée.
Pour le type d'étalonnage, sélectionnez le premier ordre, et pour le nombre de longueurs d'onde, sélectionnez un. Saisissez des nanogrammes par millilitre comme unité de concentration. Assurez-vous que les cases « étalonnage manuel » et « forcer la courbe à passer par zéro » ne sont pas cochées. Après la virgule, sélectionnez deux chiffres, saisissez zéro comme limite inférieure de concentration, et 10 000 comme limite supérieure de concentration.
Ensuite, cliquez sur l'onglet de l'instrument et, dans le champ du mode de données, sélectionnez la fluorescence. Vérifiez que le champ de vitesse de modulation est inactif, car il est uniquement utilisé pour les mesures de phosphorescence. Dans le champ du mode de longueur d'onde, sélectionnez les deux longueurs d'onde fixes ; dans le champ ex WL un, saisissez 480 nanomètres dans le champ EM WL un.
Saisissez 520 nanomètres. Laissez tous les autres champs sous EX et EM inactifs. Réglez la fente d'excitation et la fente d'émission sur 5,0 nanomètre.
À l'aide des menus déroulants, laissez la case devant le champ de tension du PMT allant de 1 à 1000 volts non cochée. Pour la tension du PMT, sélectionnez 700 volts dans le menu déroulant. Sélectionnez également deux pour le nombre de calculs statistiques automatiques, un pour les réplicats, 0,1 seconde pour le temps d'intégration et zéro pour le délai.
Ouvrez maintenant l'onglet moniteur et réglez le champ maximum de l'axe des ordonnées à 10 000 et le minimum de l'axe des ordonnées à zéro. Cochez ensuite la case située à gauche de l'option « Traiter les données après l'acquisition », et si nécessaire, la case située à gauche de l'option « Imprimer le rapport après l'acquisition » pour qu'un rapport soit imprimé automatiquement à la fin des mesures. Enfin, pour enregistrer tous les paramètres sélectionnés dans les différents onglets de la fenêtre de méthode d'analyse, cliquez sur l'onglet général et enregistrez sous un nouveau nom de fichier dans un emplacement spécifié.
Cliquez sur le bouton OK pour fermer cette fenêtre. Cela termine la configuration des paramètres de test de l'instrument. Afin de configurer le lecteur de microplaques, cliquez sur le bouton MPR pour faire apparaître la fenêtre de configuration du MPR au premier plan.
Tout d'abord, sélectionnez les puits pour les étalons. Par exemple, cliquez sur la position A1 et faites glisser la souris jusqu'à E1. Ensuite, cliquez sur le bouton définir l'étalon.
Cela permettra de sélectionner les positions à utiliser pour les étalons, mises en évidence par une couleur verte. Ensuite, sélectionnez les positions pour les échantillons. De la même manière, cliquez et faites glisser la souris sur les positions correspondantes de la plaque, puis cliquez sur le bouton de l'ensemble d'échantillons, ce qui mettra automatiquement en surbrillance les positions sélectionnées en jaune.
Continuer à répéter la même opération pour les positions des mesures d'échantillons souhaitées. Pour charger les informations concernant les étalons et les échantillons dans le fichier à variables séparées par des virgules préparé précédemment, cliquer sur l'onglet d'information des puits dans la fenêtre de configuration MPR.
Sélectionnez le bouton d'information sur les puits de chargement et une fenêtre Windows Explorer s'ouvrira pour identifier le fichier au format csv contenant les informations sur les puits. Après le chargement des données, la fenêtre doit afficher un tableau. Afin de préparer une solution working de réactif Pico green, ajoutez 50 microlitres de réactif Pico green 200 X à 9,95 millilitres de tampon TE.
Pour la courbe standard, préparez des dilutions sérielles d'ADN double brin Lambda dans un tampon TE pour des concentrations finales allant de un à 100 nanogrammes par millilitre. Pipetez 150 microlitres de chaque standard dans les puits désignés d'une plaque 96 puits. Ensuite, pipetez 150 microlitres de chaque échantillon test dans les puits correspondants de la plaque. Puis, à l'aide d'une pipette multipuits, ajoutez 150 microlitres de solution Pico green dans chaque puit et mélangez la solution et les échantillons d'ADN.
Incubez doucement la plaque dans un endroit sombre pendant deux à cinq minutes pour permettre le développement de la réaction. Cliquez sur le bouton de l'écran d'affichage MPR pour faire apparaître la fenêtre de configuration MPR au premier plan de l'affichage, puis cliquez sur le bouton d'échange de position. La plateforme de maintien de la microplaque se déplacera vers l'avant de l'appareil, ouvrira la porte du lecteur de microplaque, placera la plaque de 96 puits sur la plateforme de maintien avec le puits A1 orienté vers l'avant, puis refermera la porte du lecteur de microplaque.
Cliquez sur le bouton de position initiale pour placer la position A d'une microplaque en position de mesure. Cliquez sur le bouton d'affichage du moniteur pour faire apparaître la fenêtre de mesure au premier plan de l'écran. Cliquez sur le bouton de mesure pour commencer à mesurer les étalons et les échantillons inconnus.
Une bonne courbe d'étalonnage est évaluée à l'aide des différents paramètres fournis par le logiciel F 7,000. Par exemple, cette courbe d'étalonnage idéale obtenue pour la quantification d'ADN bicaténaire à l'aide du colorant Pico green présente un coefficient de détermination calculé de 0,99993. Le système à haut débit décrit correspond à un assemblage en série de technologies comprenant le colorant Pico Green, un spectrophotomètre de fluorescence Hitachi F 7,000 équipé d'un lecteur de microplaques et d'un programme informatique permettant d'automatiser la collecte, le stockage, l'analyse et la présentation des données.
La combinaison de technologies puissantes peut répondre au besoin croissant d'analyser avec précision de faibles quantités d'ADN double brin.
Aperçu
Cet article démontre la quantification de l'ADN double brin (dsDNA) à l'aide du colorant PicoGreen et du fluorimètre Hitachi F-7000 équipé d'un lecteur de microplaques. La procédure décrit la préparation des échantillons, la configuration de l'appareil et les étapes de mesure afin d'obtenir une courbe de calibration linéaire pour la quantification de l'ADN double brin.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Spectroscopie de fluorescence
- Quantification de l'ADN
- Technologie de lecteur de microplaques
Contexte
- Le colorant PicoGreen est un colorant fluorescent sensible utilisé pour la quantification de l'ADN bicaténaire.
- Le spectrophotofluorimètre Hitachi F-7000 est un appareil polyvalent.
- Une quantification précise de l'ADN est essentielle pour diverses expériences biologiques.
- Les systèmes à haut débit facilitent l'analyse simultanée de multiples échantillons.
Objectif de l'étude
- Démontrer les capacités du spectrophotomètre F-7000 pour la quantification de l'ADN double brin.
- Établir une méthode fiable pour mesurer des échantillons d'ADN inconnus.
- Élaborer une courbe d'étalonnage linéaire pour une quantification précise.
Méthodes utilisées
- Préparation du réactif PicoGreen et des étalons d'ADN.
- Réglage des paramètres du spectrophotomètre Hitachi F-7000.
- Chargement des échantillons dans le lecteur de microplaques.
- Mesure de la fluorescence pour générer une courbe d'étalonnage.
Résultats principaux
- Une courbe d'étalonnage linéaire a été établie pour la quantification de l'ADN double brin.
- La méthode a démontré une sensibilité et une précision élevées.
- Les résultats ont montré un coefficient de détermination de 0,99993.
- Le système a efficacement analysé de faibles quantités d'ADN double brin.
Conclusions
- La combinaison du colorant PicoGreen et du spectrophotomètre F-7000 fournit une méthode robuste pour la quantification de l'ADN.
- Cette approche à haut débit répond aux exigences d'analyse précise en recherche biologique.
- La méthode peut être appliquée à diverses études nécessitant des mesures précises d'ADN.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle dans l'industrie
La quantification précise de l'ADN double brin constitue une exigence fondamentale pour la validation de cibles, le développement de tests et la génération de modèles précliniques en recherche et développement biopharmaceutique. Le spectrophotomètre de fluorescence Hitachi F-7000 associé à la coloration PicoGreen permet une mesure sensible et haut débit de l'ADN double brin, facilitant ainsi la génération fiable de courbes standards pour les applications en aval. Cette méthode assure une confiance prédictive dans la quantification des acides nucléiques, réduit la variabilité dans les flux de travail de découverte précoce et permet une production de données reproductibles et évolutives dans les études de criblage de composés et de biomarqueurs.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet une mesure précise des concentrations d'ADN double brin pour des essais de clonage, de transfection et de validation ciblée par PCR.
- Valeur opérationnelle : Facilite la préparation et la quantification reproductibles des échantillons, réduisant ainsi la variabilité technique dans les expériences fondées sur des hypothèses.
- Valeur prédictive : Génère des courbes d'étalonnage linéaires avec des coefficients de détermination élevés (R² > 0,999), assurant une quantification précise d'échantillons inconnus dans les études d'engagement ciblé.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Fournit des lectures quantitatives de fluorescence compatibles avec les formats en plaques de 96 puits pour la standardisation des dosages et le titrage des réactifs.
- Valeur opérationnelle : Permet une mesure rapide de 96 puits en moins de 60 secondes en utilisant le mode cinétique, facilitant la préparation à un criblage à haut débit.
- Extensibilité : Le logiciel permet d'enregistrer et de rappeler des configurations de microplaques, favorisant une mise en place de dosage cohérente entre équipes et projets.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Fournit une quantification fiable de l'ADN double brin pour l'analyse de biomarqueurs, la validation par PCR et la production de vecteurs dans les modèles précliniques.
- Maîtrise des risques : Une sensibilité élevée (équivalent à 50 picomoles de fluorescéine) et une large gamme dynamique (5 ordres de grandeur) permettent une quantification précise sur des séries de dilutions, réduisant ainsi les faux négatifs pour les cibles peu abondantes.
- Intégration au flux de travail : Exporte les données vers Excel ou des formats de rapport, permettant un transfert fluide vers les pipelines bioinformatiques et analytiques.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation précoce de cibles à l'identification de composés actifs, jusqu'au développement préclinique, où une quantification précise des acides nucléiques est essentielle pour la reproductibilité expérimentale et l'intégrité des données.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses en assurant une mesure précise de l'ADN double brin pour l'efficacité du clonage, l'analyse de l'expression génique et les études de mutagenèse.
- Triage : Fournit des signaux fluorescents quantitatifs reproductibles qui renforcent la robustesse des tests et la normalisation des bibliothèques de composés.
- Analytique : Génère des courbes de calibration linéaires et des coefficients de détermination (R²) permettant la comparaison entre expériences et le contrôle qualité.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité préclinique grâce à une quantification fiable de l'ADN dans les formulations médicamenteuses, les vecteurs viraux et les dosages de biomarqueurs.
- Réutilisation en entreprise : Un logiciel configurable et des protocoles standardisés permettent une réutilisation interdépartementale, réduisant ainsi le développement répété des méthodes et augmentant l'efficacité opérationnelle.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Une sensibilité et une spécificité élevées pour l'ADN double brin réduisent les signaux faux et améliorent la fiabilité des données dans les tests moléculaires.
- Valeur opérationnelle : La collecte, le stockage et la présentation automatisés des données via un logiciel minimisent la manipulation manuelle et les erreurs de transcription.
- Valeur stratégique : Une quantification fiable soutient les décisions de poursuite ou d'abandon lors de l'optimisation des candidats, en assurant un dosage et une normalisation précis dans les tests fonctionnels.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque en fournissant des données fiables sur les acides nucléiques pour la sélection des candidats et les études de formulation.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une bonne connaissance de la spectroscopie de fluorescence et du fonctionnement d'un lecteur de microplaques.
- Suppose l'accès à un spectrophotomètre Hitachi F-7000 équipé d'un accessoire de lecture de microplaques et d'un logiciel compatible.
- Exige une préparation normalisée des réactifs (dilution de PicoGreen dans un tampon TE) et une manipulation soigneuse des échantillons afin d'éviter l'extinction de la fluorescence.
- Implique l'optimisation du temps d'incubation (2 à 5 minutes à l'abri de la lumière) et des réglages de longueur d'onde (Excitation à 480 nm, Émission à 520 nm) pour assurer la reproductibilité du signal.
- Comprend certaines limites pratiques, telles que la nécessité d'une incubation à l'abri de la lumière et la possibilité d'interférences dues à des contaminants ou à des solvants organiques.
