Assistée par ordinateur à grande échelle de visualisation et quantification de la messe des îlots pancréatiques, distribution de taille et d'architecture

L'objectif général de cette procédure est de recueillir des données représentatives non biaisées à partir d'un échantillon limité et d'analyser précisément la structure tridimensionnelle complexe du tissu. Cela est réalisé en capturant d'abord des tranches virtuelles de coupes pancréatiques immunohistochimiquement colorées. Ensuite, les tranches virtuelles sont quantifiées à l'aide du macro IHC Virtual Slice dans le logiciel ImageJ, et les données sont analysées à l'aide de scripts écrits pour Mathematica.

Ensuite, une reconstruction 3D des tranches virtuelles est réalisée à l'aide d'ImageJ. La dernière étape de la procédure consiste à capturer une pile d'images d'îlots individuels à l'aide du logiciel SlideBook, puis à cartographier manuellement les piles d'images en trois dimensions à l'aide de Stereo Investigator. Grâce à une méthode combinée d'imagerie 3D et de cartographie manuelle, il est finalement possible d'obtenir une architecture précise des îlots avec des coordonnées tridimensionnelles pour chaque cellule de l'îlot. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'étude de l'obésité et du diabète, telles que la manière dont les conditions physiologiques et pathophysiologiques affectent la distribution et l'architecture des îlots pancréatiques, ainsi que la masse des cellules bêta.

Les implications de cette technique s'étendent au diagnostic ou au traitement de l'obésité et du diabète Melitis, car une meilleure compréhension des modifications de la masse des cellules bêta facilitera le développement et l'évaluation d'interventions thérapeutiques. Bien que les méthodes décrites dans la présente étude fournissent spécifiquement des informations sur l'analyse immunohistochimique dynamique du pancréas, elles peuvent également être appliquées à une variété d'autres organismes et tissus. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes d'analyse assistée par ordinateur sont difficiles à apprendre.

En raison de la complexité de l'analyse de tels ensembles de données en deux et trois dimensions. Commencez cette procédure en plaçant une lame propre contenant une section entière d'un pancréas coloré immunohistochimiquement dans le porte-lame d'un microscope à fluorescence. Ouvrez le logiciel Stereo Investigator et visualisez l'échantillon en cliquant sur acquisition.

Ensuite, l’image en direct. Déterminez les niveaux d’exposition pour chaque canal à l’aide de la fenêtre de l’histogramme vidéo, qui affiche l’intensité de la fluorescence. Dans cet exemple, le canal deux est utilisé pour DAP P, le canal trois pour GFP, le canal quatre pour RFP, le canal cinq pour sci cinq et le canal six pour SCI sept.

À l’aide de la fenêtre des paramètres de la caméra, ajustez le niveau d’exposition de manière à ce que l’intensité de fluorescence diminue. À l’extrémité droite de l’histogramme vidéo, l’image peut être mise au point à l’aide de la molette de focalisation du microscope. Avant de créer une coupe virtuelle, délimitez l’échantillon en cliquant sur l’écran en un point éloigné de l’échantillon, ce qui marquera un point de référence.

Ensuite, cliquez autour du contour de l'échantillon lorsque le contour est complet. Cliquez avec le bouton droit et sélectionnez « fermer le contour » pour relier les points de départ et d'arrivée. Une fois le contour fermé, capturez une coupe virtuelle de l'échantillon en sélectionnant « acquisition », puis « acquérir une coupe virtuelle ». Lorsque les options de la fenêtre de coupe virtuelle s'ouvrent, sélectionnez « acquérir en haute vitesse », ainsi que la désactivation du mode manuel.

Effectuez la mise au point en décochant la case à côté de « manuel ». Enregistrez le fichier. Étalonner le préfo en cliquant avec le bouton droit et en sélectionnant « ajouter à la liste des sites de mise au point ».

Mettez manuellement au point plusieurs sections aléatoires dans l'aperçu de la coupe virtuelle. Une fois que plusieurs sites ont été mis au point, démarrez la coupe virtuelle en cliquant avec le bouton droit et en sélectionnant. Lancez la coupe virtuelle avec prefo. Après la fin de la coupe virtuelle pour le premier échantillon, passez au canal suivant et ajustez l'exposition en conséquence. Cette procédure est répétée pour chaque canal afin de quantifier les œillets. Traitez les images à l'aide d'une macro ImageJ nommée I-H-C-V-S, qui prépare d'abord les images chargées pour l'analyse, puis quantifie les caractéristiques des œillets, telles que la composition cellulaire.

La macro I-H-C-V-S sépare la pile en ses canaux de couleur respectifs. Dans Image J, chaque image est convertie en un masque noir et blanc de huit bits. Après le seuil d'intensité automatique, les images des canaux séparés sont additionnées arithmétiquement pour former un masque composite.

L'analyse de particules intégrée à Image J appliquée à l'image composite identifiera ensuite les régions d'intérêt ou ROI, tout en excluant les particules plus petites qu'une cellule bêta. La quantification des ROI. L'utilisation d'Image J produit un tableur contenant les paramètres cellulaires.

Enregistrez les résultats agrégés dans un classeur Excel. Stockez les données telles que l'aire, le périmètre, la circularité, le diamètre fer, et le centre de chaque oeillet, ainsi que les numéros correspondants étiquetés sur l'image. Une analyse informatique de ces paramètres peut être effectuée comme décrit dans le protocole écrit. Pour obtenir des informations incluant la distribution des oeillets et l'analyse de fréquence, effectuez une reconstruction 3D de tranches virtuelles en exécutant un script qui convertit toutes les images JP2 du répertoire en fichiers TIF, format utilisé lors de la construction et de la quantification d'empilements tridimensionnels à partir des tranches virtuelles.

Ici, un script appelé I MJ deux deux tiff est utilisé. Copiez le script dans le répertoire contenant les images JP deux. Exécutez le script avec le shell Linux en tapant point barre oblique I M JP deux deux TIFF dans la console, puis appuyez sur Entrée.

Une fois que toutes les images capturées ont été converties des fichiers JP2 en fichiers TIFF, elles sont prêtes à être utilisées pour l'analyse dans ImageJ. À l'aide d'ImageJ, ouvrez toutes les images du premier échantillon, qui proviennent dans ce cas d'un pancréas fœtal humain, puis fusionnez-les en une seule image en sélectionnant Image, Couleur, puis Fusionner les canaux. Répétez ce processus pour chacun des échantillons. Lorsque tous les échantillons ont été combinés en images individuelles, nettoyez les images en sélectionnant les régions indésirables à l’aide de l’outil de sélection polygonale.

Les remplir en sélectionnant modifier, puis remplir. Convertir chaque image en une image en couleurs RVB. Enfin, créer une pile à partir des images, après quoi elles peuvent être davantage alignées à l'aide du greffon stack reg.

En fin de compte, la fusion des canaux et la combinaison des images créent un montage 3D de tous les ilots dans tout le pancréas. Pour acquérir des séries d'images, placez les ilots pancréatiques en montage complet sous le microscope. Appliquez de l'eau si vous utilisez un objectif à immersion dans l'eau.

Ouvrez le logiciel de lecture des diapositives et accédez au contrôle de capture et de mise au point en appuyant sur Ctrl+Maj+E dans la fenêtre de contrôle de mise au point. Réglez l'objectif sur 20 fois ou 40 fois selon la taille de l'œillet. Pour utiliser l'oculaire du microscope afin de localiser les œillets, réglez le binoculaire sur deux fois et sélectionnez le jeu de filtres « utilisateur 1 ».

Dans la fenêtre de contrôle de mise au point, sélectionnez 100 % pour les yeux ; la densité neutre doit être réglée sur un clic pour GFP ey, puis ouvrez l’obturateur pour visualiser l’échantillon dans le slide book. Revenez à la fenêtre de contrôle de mise au point et passez au jeu de filtres fixe. Ensuite, cliquez sur G-F-P-D-S. Utilisez le joystick pour centrer le plus possible l’œilleton dans la fenêtre de la caméra.

Se focaliser à une profondeur proche du centre de l’orifice où les cellules peuvent être facilement discernées. Dans la fenêtre de contrôle de mise au point, sélectionner le zab. Utiliser la commande du microscope pour faire défiler jusqu’à la profondeur supérieure de l’orifice où les détails sont clairement visibles, puis cliquer sur « définir le haut ».

Descendez jusqu'au bas de l'œillet et cliquez sur « définir ». Clic inférieur, allez. Pour revenir au point de référence dans la fenêtre de capture, cliquez sur « avancé », puis sur « basculer en mode canal ».

Paramétrez le facteur de binning sur deux et le type de capture sur 3D à droite de la fenêtre, activez les positions supérieure et inférieure et revenez au volume central après la capture. Réglez la taille du pas sur trois. Sélectionnez le jeu de filtres sur « live » sous la boîte du jeu de filtres.

Sélectionnez DAP, E-D-S-U-G-F-P-D-S-U-R-F-P-D-S-U et SCI cinq DSU. Pour chacun, cliquez sur « trouver le meilleur » dans l'option de réglage de l'exposition. Ensuite, cliquez sur « tester » pour vous assurer que l'exposition sélectionnée est appropriée.

Cliquez sur démarrer pour commencer la capture. Une fois la capture terminée, ajustez les niveaux si nécessaire et modifiez la couleur affichée pour RFP en blanc. Enregistrez la diapositive puis accédez à l'option d'exportation en série TIFF.

Saisissez le nom de la lame suivi d'un tiret, puis enregistrez. Des dizaines de fichiers TIF individuels sont créés ; il peut donc être utile de conserver chaque pile d'images des orifices dans un dossier séparé. Pour cartographier les piles d'images, ouvrez le logiciel Stereo Investigator.

Visualisez l'image en ouvrant les séries d'images dans le menu de mise à l'échelle. Réglez la distance entre les images à trois micromètres pour corriger un fléchissement deux fois supérieur. Dans le classeur de diapositives, sélectionnez remplacer les mises à l'échelle X et Y et utilisez une valeur spécifiée pour la source des mises à l'échelle X et Y.

Entrez 0,65 pour les centres X et Y, puis zoomez sur l'image en cliquant sur le bouton de zoom, puis au milieu de l'ilôt d'intérêt dans la fenêtre macro. Délimitez au moins une cellule. À l'aide du marqueur approprié, les cellules bêta apparaîtront en vert, les cellules alpha en rouge et les cellules delta en blanc.

Marquez les cellules au centre de leur noyau, qui apparaîtront en bleu si l'échantillon a été coloré avec du DPI. Utilisez le marqueur deux pour marquer les cellules bêta, le marqueur cinq pour marquer les cellules alpha, et le marqueur six pour marquer les cellules delta. Une fois qu'au moins une cellule a été marquée, affichez la vue orthogonale à l'aide de l'icône située dans le menu supérieur, activez le filtre Z et sélectionnez l'option symétrique.

La plage doit être réglée à 15,00. À partir de la position Z = 0,0, faites défiler les niveaux Z à l’aide de la molette de la souris et marquez chaque cellule avec le marqueur approprié, en ne marquant chaque cellule qu’une seule fois au centre de sa profondeur. Une fois que tous les niveaux Z ont été marqués, la case à cocher du filtre Z peut être désactivée.

Cela affichera tous les marqueurs de tous les niveaux Z. Une fois que chaque cellule aura été marquée, enregistrez le fichier au format DAT. Ensuite, allez dans Fichier, exporter le tracé.

Enregistrez le tracé sous forme de fichier TXT. Enfin, cliquez sur « nouveau fichier de données » pour effacer l'espace de travail avant de tenter de cartographier de nouvelles ouvertures. La préparation de coupes virtuelles à partir d'un échantillon de pancréas coloré par immunohistochimie permet l'examen des cellules endocrines alpha, bêta et delta dans l'ensemble du pancréas, regroupées en îlots ; la coloration immunohistochimique de l'insuline apparaît en vert, celle du glucagon en rouge, celle de la somatostatine en blanc, et celle du DAP en bleu.

Les images sont ensuite converties en masque 8 bits après seuil automatique. L'image composite fusionnée est affichée ici. Toutefois, la distribution des œillets à l'aide de coupe virtuelle permet également une analyse individuelle dans des canaux séparés.

Ici, les vues de chaque canal sont présentées afin de révéler les cellules delta, les cellules bêta et les cellules alpha. Une analyse de particules est effectuée sur le masque composite, montrant chaque structure d'orifice numérotée et mise en évidence en bleu. L'analyse de particules des masques composites est fournie sous forme d'un tableau de données contenant des paramètres tels que la superficie, le périmètre, la circularité et différents diamètres pour chaque orifice détecté, dont les identifiants correspondent aux étiquettes numérotées sur le masque composite.

L'analyse à grande échelle de ces images permet d'obtenir des histogrammes du nombre total de cellules oculaires et de la distribution de leur taille, ainsi que des comparaisons détaillées des surfaces cellulaires alpha, bêta et delta. La cartographie des cellules oculaires et l'analyse mathématique de leur composition et de leur architecture peuvent révéler un plan focal unique à partir d'un empilement d'images 3D reconstruites d'un échantillon humain chargé dans Stereo Investigator. Ici, les cellules bêta sont en vert, les cellules alpha en rouge, les cellules delta en blanc et les noyaux en bleu.

Après la capture de différents œillets, les cellules alpha, bêta et delta sont marquées sur divers plans horizontaux ici ; des images fluorescentes et les données cartographiques correspondantes sont présentées pour trois plans focaux différents, espacés d'un intervalle de 10 microns. Une fois que les cellules alpha, bêta et delta ont été marquées sur plusieurs plans, l'œillet peut être visualisé en 3D. On observe ici une reconstruction en 3D d'un œillet sectionné en quartier, basée sur les coordonnées obtenues par la cartographie de l'œillet.

En outre, l'analyse mathématique automatisée des œillets cartographiés peut afficher la composition cellulaire et l'architecture. Ici, la fréquence relative des distances entre cellules entre deux cellules au sein d'une même population cellulaire est représentée. Également illustrée est la fréquence relative des distances entre cellules entre deux populations cellulaires différentes.

Les probabilités cumulatives des distributions des distances entre cellules pour les cellules alpha à alpha, bêta à bêta et delta à delta sont également présentées. Le test de Kolmogorov-Smirnov, ou test KS, peut être effectué sur ces probabilités afin d'obtenir les distances KS correspondantes. Une fois maîtrisées, l'imagerie à grande échelle et l'analyse d'une section tissulaire entière peuvent être réalisées en quatre heures.

La reconstruction 3D d'un fragment de tissu peut être réalisée en 30 minutes. Enfin, l'imagerie 3D et le cartographage manuel peuvent être achevés en quatre heures si l'opération est correctement effectuée. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de commencer par une coloration immunohistochimique de haute qualité des sections.

La précision de l'analyse ultérieure dépendra entièrement des données brutes. Assurez-vous également que vos ordinateurs disposent d'au moins huit gigaoctets de RAM pour traiter ce type d'analyse à grande échelle après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs, non seulement dans le domaine de l'obésité et du diabète, mais aussi dans de nombreux autres domaines utilisant l'analyse pathologique standard.

Il peut être particulièrement utile lorsque la disponibilité des échantillons est limitée. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de recueillir des données représentatives non biaisées dans un échantillon de taille restreinte en utilisant des techniques standard. La sélection d'une région spécifique uniquement peut ne pas être représentative de l'ensemble, comme nous l'avons montré à l'aide de notre étude sur la distribution des ilots pancréatiques.