Méthode d'insertion de levure Colony
22 mars 2011
Une méthode pour l'intégration des colonies de levures permettant la coupe pour la microscopie optique et électronique. Ce protocole permet la détermination de la distribution de cellules et les cellules sporulées pseudohyphal au sein des colonies fournissant un nouvel outil pour comprendre l'organisation de types de cellules dans une communauté fongiques.
L'objectif général de cette procédure est d'incorporer des colonies de levures. Pour ce faire, on commence par prélever une colonie ainsi que l'agar sous-jacent depuis une boîte de Petri, on la place sur plusieurs gouttes d'agar fondu, puis on la recouvre rapidement d'agar fondu supplémentaire. Ensuite, l'excès d'agar est retiré de la colonie afin de la rendre suffisamment petite pour s'insérer dans un moule.
La colonie incluse dans l'AER est ensuite fixée, colorée, déshydratée, puis finalement infiltrée avec de la résine spurs. Le bloc est ensuite placé dans un moule contenant de la résine spurs supplémentaire et incubé jusqu'à durcissement, puis sectionné. Enfin, des résultats peuvent être obtenus, montrant la répartition des types cellulaires au sein d'une colonie de levure par microscopie optique ou électronique.
Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la microscopie électronique à balayage est qu'elle permet de déterminer la structure interne de la colonie. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement microbien, comme la répartition des types cellulaires au sein des colonies. Cette méthode a permis d'obtenir des informations sur la structure des colonies de croce CAC, mais il est probable qu'elle puisse également être appliquée à d'autres micro-organismes.
La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la manipulation et l'incorporation des colonies peuvent être difficiles à apprendre à partir d'un protocole écrit. L'idée de cette méthode s'inspire de certaines données génétiques que nous avons publiées en 2002 et qui suggéraient que les spores n'étaient pas uniformément réparties dans les colonies. Nous avons adapté une méthode de sectionnement des colonies développée par engelberg dans le laboratoire de fin.
Commençons. Incubez initialement la levure Wild S visi sur des boîtes de gélose à 30 degrés jusqu'à l'apparition d'environ 300 colonies. À l'aide d'une spatule fine, prélèvez les colonies de un à deux millimètres de diamètre, une par une, à partir de la boîte.
Ensuite, à l’aide d’une pipette de un millilitre munie d’un embout, déposer plusieurs gouttes d’agarose à 2 % à 42 degrés Celsius sur une lame de microscope, puis placer immédiatement la colonie sur l’agar, face vers le haut, avant que l’agarose ne durcisse. Ajouter plusieurs gouttes supplémentaires d’agarose sur la colonie et laisser durcir l’agarose, en veillant à ce que toute la colonie, y compris sa partie supérieure, soit entièrement encapsulée dans l’agarose. Pour toutes les étapes ultérieures du protocole, utiliser un scalpel.
Retouchez l'ERA autour de la colonie et placez le fragment d'ERA contenant la colonie. Dans un flacon vissable en verre borosilicaté de 3,5 millilitres contenant un fixateur à 2 % de paraformaldéhyde et 2 % de glutaraldéhyde, les colonies doivent être traitées une à la fois afin d'éviter le dessèchement, mais jusqu'à 10 colonies peuvent être placées dans le même flacon. Laissez les colonies pendant sept jours à quatre degrés Celsius.
Après une semaine, retirez le fixateur et lavez deux fois les colonies agraires avec environ 1,5 millilitre de chlorure de sodium 0,15 M, tamponné à pH 7,2, et incubez sur de la glace pendant 15 minutes après chaque lavage, sans agitation. Effectuez ensuite deux autres lavages.
À l’aide de 1,5 millilitre de tampon X OS, composé de 100 millimolaire de phosphate monopotassique, 10 millimolaire de chlorure de magnésium à pH 6,0, incuber sur glace pendant cinq minutes après chaque lavage. Ensuite, à l’aide du même flacon, effectuer le traitement à l’osmium et les lavages indiqués ici et dans la partie écrite de ce protocole. Puis, à nouveau à l’aide du même flacon, effectuer les déshydratations progressives indiquées ici et dans le protocole écrit accompagnant, tôt le lendemain matin.
Préparez le réactif spurs comme indiqué ici et dans le protocole écrit accompagnant. Lavez immédiatement les blocs d'agarose cinq fois pendant 10 minutes chacun avec 1,5 millilitre d'éthanol à 100 % à température ambiante. Après le dernier lavage à l'éthanol, retirez uniquement suffisamment d'éthanol pour que le bloc d'agarose reste recouvert.
À l’aide d’une pipette Pasteur, introduire environ 0,5 millilitre de réactif Spurs dans le flacon et faire tourner sur une roue à faible vitesse pendant 15 minutes. Après la rotation, laisser reposer le flacon à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, éliminer complètement la solution.
Ensuite, ajoutez 1,5 millilitre de réactif spurs pour recouvrir le bloc agri. Faites de nouveau tourner le flacon sur une roue pendant 15 minutes à température ambiante et laissez reposer pendant 30 minutes. Répétez ce lavage.
Répétez l'étape trois fois supplémentaires. Après les 30 minutes finales, retirez le réactif spurs et ajoutez du réactif spurs frais pour recouvrir les blocs. Laissez les blocs agri en contact à température ambiante pendant quatre heures.
Remplacez le réactif Spurs et faites tourner toute la nuit. Le lendemain matin, remplacez le réactif Spurs et laissez les tubes en rotation jusqu'au jour suivant. Le matin suivant, placez le réactif Spurs dans des moules en silicone numérotés de manière à recouvrir juste le fond des moules.
Placez ensuite les blocs d'agar dans les moules et incubez à 60 degrés Celsius pendant quatre heures. Après quatre heures, complétez les moules avec davantage de pointes, de réactif, et incubez à 60 degrés Celsius toute la nuit. Retirez les blocs du moule pour la sectionnement.
Un exemple de microphotographie en lumière d'une coupe au centre d'une colonie de levure Wild S Visia est présenté ici. Cette levure est une souche de type sauvage isolée à partir d'exsudats végétaux. La colonie a été incubée pendant six jours sur milieu YNA avant d'être sectionnée.
Dans cette image, les formes en « asai », les formes pseudo hyphy et les levures ovoïdes sont facilement distinguables, et la région de la colonie qui envahit l'agar sous-jacent est également visible. Les flèches ouvertes indiquent des exemples de formes en « asai », les flèches pleines indiquent des cellules végétatives ovoïdes représentatives, et les pointes de flèche pleines indiquent des chaînes de cellules allongées et si. Cette image illustre un exemple de micrographie électronique d'une coupe mince d'une souche de laboratoire de levure SH 1 0 2 0 et W 3 0 3. Contexte.
La colonie a été incubée pendant six jours sur milieu YNA avant d'être sectionnée. L'image montre une région de la colonie contenant une forte fréquence de cellules sporulées. Une flèche indique la structure en double couche de la paroi du spore.
Dans la partie A, nous montrons une section d'une colonie de quatre jours avec une grille composée de 15 rectangles superposée à l'image dans la partie B. La fréquence des cellules liées aux spores dans chaque rectangle est représentée par les 15 barres correspondant aux 15 rectangles illustrés dans la partie A. Les données correspondent à la moyenne et à l'erreur standard de quatre colonies indépendantes de quatre jours. Dans la partie C, les moyennes et les erreurs standard pour quatre colonies indépendantes de huit jours sont présentées. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux semaines, avec une journée complète et plusieurs journées de une à trois heures. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'ajouter les solutions immédiatement afin que les blocs ne s'assèchent pas après cette procédure.
D'autres méthodes, comme la microscopie électronique immunocytochimique, pourraient éventuellement être utilisées afin de déterminer la répartition des cellules exprimant des protéines particulières après leur développement. Cette technique nous a permis d'examiner non seulement le schéma de disposition des cellules sporulées, mais aussi celui des cellules pseudo-hyphales dans les colonies de croce CCI. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment inclure des colonies de levures en vue de leur sectionnement.
N'oubliez pas que de nombreux réactifs de microscopie utilisés dans ce protocole peuvent être extrêmement dangereux. Veuillez vous souvenir d'utiliser une hotte aspirante, de porter des vêtements de protection et d'éliminer correctement les réactifs. Très bien, c'est tout.
Merci d'avoir regardé. Bonne chance avec vos expériences.
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Aperçu
Cet article présente une méthode d'encapsulation de colonies de levures, permettant leur sectionnement pour la microscopie optique et électronique. Le protocole facilite l'analyse des cellules sporulées et des cellules pseudohyphales au sein des colonies, contribuant ainsi à la compréhension de l'organisation des types cellulaires dans les communautés fongiques.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Microbiologie
- Biologie cellulaire
- Biologie fongique
Contexte
- Les colonies de levures présentent des types cellulaires variés.
- Comprendre la distribution des cellules est essentiel pour l'étude des communautés fongiques.
- Les méthodes traditionnelles peuvent ne pas fournir d'informations détaillées sur l'organisation cellulaire.
- Cette méthode offre une nouvelle approche pour la visualisation.
Objectif de l'étude
- Développer un protocole pour l'encapsulation de colonies de levures.
- Permettre une analyse détaillée de la distribution des types cellulaires.
- Approfondir la compréhension de l'organisation des communautés fongiques.
Méthodes utilisées
- Prélèvement de colonies de levures à partir de plaques d'agar.
- Inclusion des colonies dans de l'agar fondu.
- Élimination de l'excès d'agar pour ajuster aux moules.
- Fixation, coloration, déshydratation et infiltration avec de la résine.
Résultats principaux
- Inclusion réussi de colonies de levures pour la microscopie.
- Visualisation de cellules sporulées et de cellules pseudo-hyphales.
- Analyse détaillée de la répartition des types cellulaires au sein des colonies.
- Nouvelles perspectives sur l'organisation des communautés fongiques.
Conclusions
- La méthode d'encapsulation est efficace pour l'analyse en microscopie.
- Elle constitue un outil précieux pour l'étude de la structure des colonies de levures.
- De futures recherches pourront s'appuyer sur cette méthode afin d'explorer les interactions fongiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La compréhension de l'organisation spatiale des types cellulaires au sein des communautés microbiennes soutient la validation de cibles dans la découverte d'agents antimicrobiens et antifongiques. Cette méthode permet une détection mécanistique des risques en révélant l'hétérogénéité phénotypique susceptible d'influencer la réponse aux médicaments et le développement de résistances. Elle offre une confiance prédictive pour le criblage en phase précoce en reliant l'architecture des colonies à des sous-populations fonctionnelles.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en visualisant la répartition des cellules sporulées et pseudohyphales au sein des colonies.
- Valeur opérationnelle : Soutient la détection biologique des risques grâce à l'observation directe du modèle de types cellulaires associé à des états fonctionnels.
Tests et développement de dosages
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes biologiques validés pour des applications ultérieures en préservant les relations spatiales entre les types cellulaires.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation et la reproductibilité des tests grâce à un découpage et une imagerie cohérents des structures internes des colonies.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Aborde la pertinence pathologique grâce à la visualisation de régions colonisées modélisant la pénétration microbienne dans les tissus hôtes.
- Valeur opérationnelle : Décrit une continuité allant de la découverte à la validation préclinique en permettant une corrélation structurale avec les résultats phénotypiques.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Place la méthode dans la phase de découverte précoce menant à l'identification de composés en permettant un phénotypage structural qui éclaire les décisions de criblage de composés.
- Biologie du Dépistage : Explique comment la méthode permet de tester des hypothèses et de clarifier des voies biologiques grâce à l'imagerie directe de la distribution asymétrique des cellules.
- Surveillance : Décrit la préparation de tests par la production de coupes épaisses et fines compatibles avec la microscopie optique et électronique.
- Analytique : Met en évidence les résultats quantitatifs tels que la cartographie de la fréquence des cellules sporulées dans différentes régions de la colonie, permettant des analyses comparatives.
- Recherche Translationnelle : Relie la méthode à une application préclinique en associant les fronts envahissants des colonies à des modèles de pénétration tissulaire.
- Réutilisation en Milieu Professionnel : Présente la méthode comme une capacité réutilisable pour l'analyse structurale de diverses souches fongiques et sous différentes conditions.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive, validation des cibles, réduction de l'ambiguïté mécanistique dans le comportement des communautés microbiennes.
- Valeur opérationnelle : Normalisation, reproductibilité et évolutivité de la préparation des colonies pour des chaînes de microscopie partagées par plusieurs utilisateurs.
- Valeur stratégique : Meilleures décisions d'aller/arrêt, efficacité du capital et réduction des risques biologiques en phase avancée grâce à une détection précoce des risques phénotypiques.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation et prise de décisions d'avancement ajustées au risque, fondées sur des biomarqueurs structuraux de la virulence ou de la persistance.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Expertise scientifique requise en histologie, microscopie et manipulation de micro-organismes.
- Besoins en instrumentation et en infrastructure analytique, notamment des microtomes, des microscopes optiques et électroniques, ainsi que des systèmes d'infiltration de résine.
- Exigences de standardisation entre équipes pour les protocoles de fixation, de coloration et de sectionnement, communs aux groupes de microbiologie et d'imagerie.
- Considérations d'adaptation selon les systèmes modèles, tels que les bactéries formant des biofilms ou d'autres espèces de levures présentant des morphologies de colonies variables.
- Limites pratiques appuyées par les données disponibles, incluant des contraintes de taille des colonies (diamètre de 1 à 2 mm) et une durée de traitement s'étalant sur plusieurs jours, nécessitant une technique stérile pour éviter toute contamination.
