Une analyse boîte à outils de l'évaluation biochimique, structurel et transcriptomique globale des biofilms buccaux médiée par Streptococcus mutans

Les biofilms formés sur les surfaces dentaires sont hautement complexes et structurés. Des communautés microbiennes emprisonnées dans une matrice extracellulaire, exposées à des défis environnementaux constants. L'objectif global ici est de présenter deux composants spécifiques d'une boîte à outils analytique conçue pour faciliter les études structurales et moléculaires, tenant compte de la nature complexe des biofilms oraux en combinant une nouvelle technique d'imagerie par fluorescence avec un logiciel sur mesure pour le traitement et l'analyse des données.

Cela est réalisé en sélectionnant d'abord des tests spécifiques pour l'analyse des biofilms, du transcriptome et de la structure, y compris une nouvelle approche d'imagerie confocale permettant la visualisation simultanée des EPS et des bactéries. La deuxième étape de la procédure consiste à recueillir les données brutes provenant des biossais. La troisième étape consiste à traiter les données brutes à l'aide de logiciels spécifiques, notamment le duo stat récemment développé pour l'analyse de la colocalisation.

La dernière étape consiste à analyser les données du processus, notamment à l'aide de logiciels d'exploration et d'organisation des données de puces à ADN, tels que le logiciel microarray, data visualizer ou MDV. En définitive, des résultats peuvent être obtenus qui montrent comment les pathogènes buccaux modifient leur transcriptome et l'architecture des biofilms en réponse à un régime alimentaire complexe et aux interactions hôte-microbiote, grâce à notre boîte à outils analytique intégrée de manière unique, offrant ainsi une analyse des biofilms et une interprétation des données plus complètes. Bonjour, je m'appelle Michelle Kuh, professeure associée au centre de biologie orale du centre médical de l'Université de Rochester.

Aujourd'hui, nous présentons un ensemble d'outils analytiques pour l'analyse des biofilms. Cet ensemble d'outils peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur les biofilms, telles que la structure des cellules du biofilm, leur organisation avec la matrice extracellulaire et leur réponse à des défis environnementaux complexes au niveau transcriptomique. Je m'appelle Jean, elle, je suis chercheuse postdoctorante dans le laboratoire du Dr. K.

Aujourd'hui, je vais démontrer la partie imagerie de notre boîte à outils. Bonjour, je suis Aise Klein. Je suis professeure assistante de recherche au laboratoire du Dr. Ks.

Aujourd'hui, je vais présenter le logiciel MDV pour l'analyse des données de microray. Dans cette procédure, des disques d'hydroxyapatite recouverts de salive sont utilisés comme substituts de surface dentaire sur lesquels des biofilms sont cultivés. Ajoutez d'abord 2,8 millilitres de milieu de culture inoculé avec S. mutants dans chaque puits d'une plaque de 24 puits, protégez la plaque de la lumière, ajoutez le colorant LOR 6 47 conjugué à la dextrine dans chaque puits à une concentration finale de un micromolaire, puis pipetez plusieurs fois vers le haut et vers le bas pour mélanger le colorant au milieu de culture.

Ensuite, à l’aide de pinces stériles, plongez et rincez deux fois les disques d’hydroxyapatite recouverts de salive stérile dans du tampon AB stérile afin d’éliminer l’excès de salive ou les composants salivaires non liés. Puis, placez les disques verticalement dans le milieu de culture supplémenté en colorant, en veillant à ce que chaque disque soit complètement immergé. Recouvrez la plaque de papier d’aluminium et incubez-la à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone pendant 20 heures, afin de permettre la formation des biofilms et l’incorporation de la texture conjuguée dans les polysaccharides extracellulaires produits par les cellules bactériennes.

Pour marquer d'abord les cellules bactériennes, préparez une plaque de 24 puits contenant 2,8 millilitres d'eau stérile milli Q par puits. Ajoutez 1,5 microlitre de colorant cyto nine à chaque puits pour obtenir une concentration finale de un micromolaire et protégez la plaque de la lumière. Une fois le biofilm formé, retirez la plaque contenant les disques de l'incubateur dip.

Lavez chaque disque dans une solution de chlorure de sodium à 0,89 %. Transférez-les ensuite dans la nouvelle plaque contenant le colorant cyto neuf. Recouvrez la plaque de papier d'aluminium et incubez pendant 30 minutes à température ambiante.

Une fois que les cellules ont été colorées, plongez-les, puis lavez les biofilms et le chlorure de sodium comme précédemment. Ensuite, à l’aide de pinces, détachez les biofilms du fil et déposez-les dans une boîte de Pétri contenant du chlorure de sodium. Enveloppez la boîte de Pétri avec du papier d’aluminium.

Les biofilms sont désormais prêts à être visualisés par microscopie confocale à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser. Analyser chaque biofilm à cinq à dix positions choisies aléatoirement et générer des séries en Z à chaque position. Pour permettre des reconstructions en 3D, ouvrir les images confocales et les traiter à l’aide d’un logiciel de traitement d’images.

Ce rendu tridimensionnel d'images confocales produites à l'aide du programme Amira montre un biofilm de mutants S formé sur une surface apathique selon la procédure décrite. Les cellules bactériennes et les microcolonies, visibles en vert, sont intégrées dans la matrice du biofilm contenant des exopolysaccharides. En rouge, un agrandissement d'une zone sélectionnée peut être généré, illustrant la relation structurelle spécifique entre les bactéries et les EPS à l'échelle microscopique.

Utilisez le programme duos stat pour quantifier le taux de colocalisation des composants distincts du biofilm, tels que les bactéries et les polysaccharides extracellulaires. Tout d'abord, configurez le chemin d'accès du programme duo stat nouvellement développé dans MATLAB version 5.1 et ouvrez les dossiers d'images contenant les séries Z des deux composants du biofilm. Ensuite, sélectionnez deux canaux qui seront corrélés et analysés.

Les deux piles d'images doivent avoir des tailles de pixel identiques dans toutes les dimensions et le même nombre d'images dans chaque pile. Réglez les seuils pour chaque canal et suivez les instructions de l'interface logicielle, puis saisissez les données dans le fichier de traitement des données pour analyse. Cette figure montre comment la pile double interprète quantitativement la relation spatiale entre les bactéries et les DBS.

Dans le biofilm, Duo stack calcule la répartition verticale des bactéries et de la MPR depuis la surface du disque jusqu'à la phase fluide, comme illustré ici par la ligne verte pour les bactéries et la ligne rouge pour la MPR. Il calcule également la colocalisation des bactéries et de la MPR à travers l'épaisseur du biofilm. Comme indiqué par la ligne jaune, les données montrent des proportions plus élevées de MPR que de bactéries selon la profondeur du biofilm, et la majorité des cellules bactériennes sont associées à la MPR, en particulier à partir des couches intermédiaires et supérieures. Duo stat, avec rendu 3D, permet une meilleure compréhension de l'organisation structurale et des interactions entre les bactéries et la MPR dans les biofilms.

Afin de garantir l'obtention d'ARN de haute qualité à partir de biofilms, nous recommandons d'effectuer l'extraction d'ARN selon le protocole spécifique aux biofilms décrit dans l'article de Curian KU publié en 2007. Dans la revue, des protocoles normalisés d'analyse biochimique sont utilisés pour la préparation des puces à ADN et les tests de PCR quantitative en temps réel. Afin de faciliter l'analyse des grands ensembles de données générés par les expériences de puces à ADN, nous avons conçu un logiciel de fouille et d'organisation des données, le visualisateur de données de puces à ADN ou MDV, disponible en ligne à l'adresse www.oralgen.anl.gov.

Avant de soumettre les données à MDV, effectuez une analyse statistique telle qu'un test T apparié avec un modèle de variance aléatoire à l'aide du logiciel BRB Array Tools disponible en ligne, en utilisant une valeur de P seuil de 0,001 pour la comparaison de classes. Dans cet exemple, l'analyse des biofilms de s. muttonii cultivés dans trois concentrations distinctes de sucres et à quatre points temporels a été réalisée. Des comparaisons appariées ont été effectuées, produisant trois fichiers BRB : condition A, 0,5 % de saccharose plus 1 % d'amidon versus 1 % de saccharose ; condition B, 0,5 % de saccharose plus 1 % d'amidon versus 0,5 % de saccharose ; et condition C, 0,5 % de saccharose versus 1 % de saccharose.

Ce panneau représente le nombre de gènes détectés comme étant exprimés de manière différentielle dans chaque condition et chaque point temporel évalué par une comparaison de classes standard à l'aide de l'outil BRB Array, ce qui donne un grand nombre de gènes désignés comme données brutes BRB. Pour la démonstration de MDV, nous nous concentrerons sur le point temporel de 30 heures en utilisant Excel. Convertissez les données brutes BRB en fichiers texte tabulés MDV.

Veillez à supprimer toutes les lettres qui accompagnent le numéro de l'onglet du locus génique, par exemple dans le nom SMU dot 1432 C. Supprimez la lettre C, ouvrez MDV. Ouvrez le menu Fichier et choisissez Sélectionner la source d'annotation. Sélectionnez l'option de fichier plat lorsque une boîte de dialogue apparaît.

Utilisez les boutons de navigation pour choisir les fichiers contenant les annotations relatives aux données de classification fonctionnelle des voies du nombre d'ontologie génique et au nom du gène. Accédez au fichier et importez chacun des fichiers convertis au format MDV. Chaque fichier représente une condition expérimentale.

Comparer les gènes exprimés dans chaque condition expérimentale A par rapport à B par rapport à C. Dans cet exemple, en utilisant la fonction du diagramme de Venn. Pour cette démonstration, nous nous concentrons sur les gènes exprimés de manière différentielle qui sont spécifiquement liés aux effets combinés du saccharose et de l'amidon. La fonction basée sur le diagramme de Venn permet de visualiser le nombre de gènes uniques et partagés exprimés dans ces différentes conditions et nous aide à identifier ceux qui seront sélectionnés pour des analyses ultérieures.

Ici, nous sélectionnons uniquement les gènes exprimés de manière différentielle qui sont uniques dans la condition A et/ou B, mais pas ceux détectés dans C, indiqués en gris comme illustré ici. MDV a fortement réduit le nombre total de gènes à analyser, tout en filtrant simultanément les gènes non pertinents pour le cas expérimental. Dans le menu Fichier, choisissez l'option d'exportation pour enregistrer les données.

Sous forme de fichiers délimités par des tabulations, les fichiers peuvent ensuite être ouverts dans Excel, où les données produites peuvent être organisées et converties en représentations graphiques souhaitées. L'organisation des données dans Excel permet l'affichage graphique des résultats MDV. Ce graphique présente un aperçu de l'expression différentielle de sous-ensembles fonctionnels uniques de gènes affectés par la combinaison d'amidon et de saccharose à des stades distincts du développement du biofilm.

Les influences sur le transcriptome des mutants S sont plus marquées à 30 heures de développement du biofilm qu'à d'autres moments. Ces résultats nous ont permis d'identifier précisément des sous-ensembles fonctionnels spécifiques de gènes pertinents pour notre hypothèse de travail, en tenant compte des effets temporels qui ont facilité la sélection des gènes et le processus de validation ultérieure. Suite à cette procédure, des méthodes biochimiques et protéomiques peuvent également être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que quelles sont les réponses physiologiques et métaboliques spécifiques des organismes au sein des biofilms.

Une telle analyse complète et intégrée aiderait certainement à mieux comprendre comment les biofilms modulent la pathogénicité dans la cavité buccale, un environnement hautement dynamique et complexe. Pour plus de détails, veuillez consulter le fichier PDF joint à cet article vidéo.