Amélioration de la visualisation et l'analyse quantitative des effets des drogues utilisant des cellules Micropatterned

L'objectif général de la procédure suivante est de montrer comment la normalisation de l'architecture cellulaire et de la position, obtenue grâce à des motifs microscopiques adhésifs spécifiques, permet une automatisation facile de l'acquisition d'images et un traitement d'images simple, avec une quantification sensible et robuste des effets des médicaments, ce qui est inatteignable sur des supports conventionnels en lame de verre. Ceci est réalisé en semant des cellules heli sur des puces SI deux portant des motifs microscopiques en forme de L marqués SI trois. Les cellules adoptent une forme triangulaire en formant une fibre de stress majeure s'étendant entre les deux extrémités du L. Les cellules sur motifs sont ensuite incubées avec de la lebos statine ou laissées non traitées, puis fixées et colorées afin de visualiser le cytosquelette d'actine et les noyaux.

Des images des cellules en micropattern sont ensuite acquises et traitées à l'aide du macrocellulaire ref pour générer une pile d'images destinée à l'analyse, et du macrohypoténuse pour quantifier les phénotypes. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent un effet significatif de faibles doses de statine BLE sur les cellules HELOC en micropattern, effet indétectable dans des conditions standard de culture cellulaire. Bonjour, bienvenue.

Nous sommes ici aujourd'hui pour vous guider à travers notre protocole expérimental expliquant comment utiliser des micros motifs adhésifs pour l'analyse cellulaire, ainsi que pour vous montrer des données expérimentales illustrant la quantification facile de très faibles doses de médicaments sur ces micros motifs adhésifs. Dès que vous verrez ces micros motifs, vous comprendrez immédiatement comment ils permettent de résoudre les problèmes de variabilité lors de la capture d'images en analyse cellulaire. En effet, grâce à un arrangement bien ordonné de cellules, semblable à une matrice microscopique, il devient facile de déplacer progressivement la platine du microscope d'une cellule à l'autre afin de capturer les images de manière séquentielle.

Mais ce n’est évidemment pas le seul avantage offert par les micros motifs. Ils apportent bien davantage d’améliorations, car en réalité, sur certains micros motifs typiques tels que le croisillon ou le Y, nous normalisons en fait l’architecture interne des cellules, ce qui signifie que les organites, le fuseau mitotique, le cytosquelette et les différents réseaux protéiques se retrouvent tous dans les mêmes emplacements d’une cellule à l’autre, ou dans la même orientation d’une cellule à l’autre, ce qui rend beaucoup plus facile la prédiction et la quantification des effets des médicaments sur ces motifs particuliers. Cela peut sembler assez contre-intuitif par rapport à ce qui est habituellement fait dans la boîte de Pétri classique ou la microplaque.

Eh bien, parce qu'on observe souvent, bien sûr, des cellules en déplacement adoptant différentes morphologies. Alors que sur les micro-motifs adhésifs, toutes les cellules finissent par se ressembler, car elles répondent à ce micro-motif adhésif et organisent leur architecture de la même manière. Cela peut sembler en effet un peu artificiel, mais lorsqu'on y regarde de plus près, la boîte de Pétri ne serait-elle pas encore plus artificielle ?

Étant donné que, dans les tissus, les cellules sont contraintes par les cellules voisines ainsi que par la matrice extracellulaire, elles reçoivent énormément d'informations spatiales, qui orientent l'architecture cellulaire. Et c'est cette approche basée sur des micro-motifs que nous mettons en œuvre.

Nous restaurons cette information spatiale aux cellules, et toutes les cellules y répondent et s'organisent de la même manière. Et maintenant, puisque toutes les cellules se ressemblent, nous pouvons introduire le concept de cellule de référence, ce qui signifie que nous pouvons faire la moyenne de toutes les images et obtenir une image unique, qui représente fidèlement l'aspect de la cellule dans une condition donnée. Ensuite, vous pouvez ajouter un médicament et observer à nouveau la cellule de référence pour voir comment la morphologie ou l'organisation de la cellule a été modifiée en réponse à ce médicament.

Placez individuellement deux puces situ two dans deux puits indépendants d'une plaque à six puits, en veillant à ce que le logo situ two soit lisible. Les puces situ two utilisées pour cette expérience présentent des micros motifs marqués avec FibroGen SI three et doivent être conservées à l'abri de la lumière avant utilisation. Récupérez les cellules HeLa d'une confluence d'environ 80 % à l'aide de trypsine et vérifiez qu'elles sont correctement individualisées au microscope, puis centrifugez-les à 300 ×g pendant quatre minutes et remettez délicatement les cellules en suspension. Comptez-les et diluez-les jusqu'à une concentration de 15 000 cellules par millilitre.

Dans le milieu de culture D-M-E-M-F 12 incomplet, distribuer 60 000 cellules par puits. Il faut déplacer la plaque le moins possible afin d'éviter d'induire des mouvements de rotation dans le milieu, qui auraient tendance à concentrer les cellules au centre. Laisser les cellules se sédimenter pendant 10 minutes sous la hotte, puis les transférer dans l'incubateur à cellules.

Entre 10 et 20 minutes dans l’incubateur de cellules, les cellules commenceront à adhérer après 10 minutes ; vérifiez régulièrement au microscope quand les cellules se sont fixées. Changez le milieu cellulaire et éliminez l’excès de cellules en répétant la procédure suivante quatre fois. En maintenant la plaque à plat, aspirez délicatement le milieu sur le côté du puits.

Faites attention de conserver suffisamment de milieu pour éviter que la puce ne s'assèche. Ajoutez quatre millilitres de PBS et aspirez en partant du centre de la puce. Puis, déplacez-vous vers le côté du puits pour aspirer la majeure partie du PBS comme précédemment, et vérifiez au microscope la présence de cellules en suspension.

Si un grand nombre de cellules en suspension persistent, répétez la procédure de lavage. S’il reste très peu de cellules, aspirez une partie du PBS et remplacez-le par deux millilitres de milieu frais, aspirez à nouveau, puis ajoutez quatre millilitres de milieu frais deux fois. Incubez les cellules pendant trois heures dans une incubateur cellulaire afin de permettre aux cellules de s’étaler complètement.

À l’aide de cette méthode, entre 10 et 30 % des microstructures seront occupées par une seule cellule, tandis que d'autres structures seront soit vides, soit occupées par plusieurs cellules. Pour traiter les cellules avec l'inhibiteur de la BLE, diluez la solution mère du médicament à 17 millimolaire jusqu'à une concentration finale de cinq micromolaires avec 0,1 % de DMSO dans quatre millilitres de milieu. Pour le témoin, préparez un milieu contenant uniquement 0,1 % de DMSO, aspirez le milieu des cellules, puis remplacez-le rapidement par la solution d'inhibiteur de la BLE ou par la solution témoin afin d'éviter que la puce ne s'assèche.

Incubez les cellules pendant une heure à 37 degrés Celsius. Pendant cette incubation, préparez le tampon de cytosquelette. Ajoutez un gramme de saccharose à deux millilitres de cb.

Cela permet de préserver les structures cellulaires internes. Mélangez un millilitre de saccharose dans le tampon CB avec quatre millilitres de PFA à 5 %. Ajoutez deux millilitres de PFA dans la solution de saccharose en tampon CB.

Dans deux puits d'une nouvelle plaque à six puits. Pour fixer les cellules, utilisez une pince pour saisir la puce CY2 et placez-la dans la plaque à six puits contenant deux millilitres de PFA dans une solution de saccharose CB. Incubez les cellules pendant 10 minutes à température ambiante, retirez le PFA puis lavez les cellules une fois avec du PBS, puis lavez les cellules avec deux millilitres de chlorure d'ammonium 100 millimolaire pendant 10 minutes.

Pour inhiber l'activité résiduelle de réticulation du PFA, rendre les cellules perméables en ajoutant deux millilitres de PBS contenant 0,1 % de Triton X-100 pendant trois minutes, puis laver deux fois avec du PBS. Colorer les filaments d'actine avec deux millilitres de phalloïdine conjuguée ZI à une dilution de un sur 2000 dans du PBS contenant 1,5 % de BSA, puis incuber pendant une heure à température ambiante. Ensuite, laver les cellules une fois avec deux millilitres de PBS. Puis, colorer les noyaux.

Ajoutez deux millilitres d'un milligramme par millilitre de hawked dans du PBS et incubez pendant trois minutes à température ambiante. Lavez deux fois avec deux millilitres de PBS. Montez les deux puces latérales sur une lame standard en utilisant de 25 à 30 microlitres de solutions de montage telles que al.

Pour acquérir des images à trois longueurs d'onde, nous utilisons le logiciel d'imagerie Metamorph et un microscope NIK icon eclipse T, équipé d'une caméra CCD Hema Matsu et d'un éclairage à fibre de mercure Intens Lite. Commencez par sélectionner un grossissement de 20 x.

Ensuite, dans la barre de menu, ouvrez l'acquisition multidimensionnelle pour configurer les différents paramètres de l'expérience. Indiquez d'abord l'emplacement où enregistrer vos données.

Régler le nombre de longueurs d'onde sur trois, sélectionner les trois longueurs d'onde SI et positionner la lame recouverte de lamelle de manière à ce que 12 micro motifs soient centrés dans le champ de la caméra. Le nombre de micro motifs visualisés par champ variera selon les configurations de la caméra et de l'objectif. Régler le temps d'exposition pour chaque longueur d'onde et la mise au point automatique.

Pour PS trois, créez un journal exécutant une acquisition multidimensionnelle et enregistrez-le sous le nom MDA jnl. Ouvrez la fonction de balayage de la platine pour acquérir 24 images, chacune contenant 12 micro-motifs. Saisissez six colonnes et quatre lignes avec un pas x de -400 micron et un pas y de 300 micron dans « set journal to execute », chargez le journal MDA jnl, puis appuyez sur « scan » pour démarrer l'acquisition automatisée des 24 images selon les trois longueurs d'onde.

Dans cette vidéo, des motifs micro en L sont utilisés pour déclencher la formation d'une unique fibre majeure de stress actinique qui soutient la partie non attachée de la cellule et simplifie la visualisation et la mesure de l'impact des statines sur les cellules, par rapport aux cellules fixées sur de la fibronectine ordinaire. Pour le traitement et l'analyse automatisés des images, nous décrivons deux macros personnalisées conçues pour le logiciel libre ImageJ : à partir d'une pile d'images brutes, la première macro extrait les cellules individuelles et crée une cellule de référence. La seconde macro mesure l'effondrement de la membrane cellulaire.

La première étape consiste à segmenter les cellules individuelles à partir des images brutes. Les images de micro motifs marqués par fluorescence sont utilisées pour délimiter des régions centrées sur les micro motifs, qui sont découpées sur les images pour chaque longueur d'onde puis réassemblées en piles pour chaque longueur d'onde. Afin de sélectionner les micro motifs contenant une cellule unique, le macro-détection identifie le nombre de noyaux par image et élimine, dans toutes les piles, les images contenant soit plus d'un noyau, soit aucun noyau.

Enfin, le plugin Image J multi-stack reg est utilisé pour réaligner toutes les images collectées et tous les canaux en fonction de la position du micromotif. Cette étape génère des piles en ligne d'images individuelles qui peuvent désormais être utilisées pour l'analyse de cellules uniques ou pour créer une cellule de référence. Dans Image J, la cellule de référence est construite en réalisant une projection des images filtrées et alignées à partir d'une pile.

Plusieurs méthodes de projection peuvent être appliquées, mais on choisit généralement une projection médiane afin d'éliminer les valeurs aberrantes de la pile d'images. La cellule de référence est un outil unique et utile pour la représentation et l'analyse d'images, disponible uniquement avec des cellules en micropattern. Pour faciliter son examen, une table de correspondance (LUT) est appliquée afin de convertir l'image en niveaux de gris en une carte de fréquences codée.

Pour caractériser l'effet des statines sur les BLE, la rigidité et l'effondrement de la cellule ont été analysés à l'aide d'une macro-image J secondaire. Brièvement, des images seuil du motif micro-L sont utilisées pour définir une hypothénuse théorique de la forme triangulaire de la cellule. Ensuite, un seuillage des images de coloration de l'actine est effectué pour définir la forme de la cellule.

La différence de surface entre l'hypoténuse théorique et la membrane cellulaire concave réelle est ensuite mesurée ; les cellules présentant une surface située sous l'hypoténuse théorique sont considérées comme effondrées. L'impact d'une statine BLEs à cinq micromolaire a été caractérisé en comparant le nombre de cellules effondrées dans les conditions traitées et les conditions témoins. Des images typiques de cellules microdessinées de taille L, traitées avec la statine BLEs ou non traitées, sont présentées ; les cellules ont été fixées et colorées selon des microdessins.

L'actine et les noyaux sont représentés en rouge, vert et bleu respectivement. Remarquez l'impact des statines BLE sur la forme cellulaire par rapport aux conditions témoins. Des cellules représentatives après incubation avec des statines BLE ou des témoins sur de la fibronectine simple sont montrées ici.

Les cellules ont été fixées et colorées, l'actine et les noyaux apparaissant en vert et en bleu respectivement. Remarquez la similarité entre les conditions traitées et les conditions contrôles. Des images typiques de cellules de référence obtenues à partir de cellules traitées avec des statines BLE ou laissées non traitées sont présentées.

Notez le potentiel de cette approche pour une observation facile du phénotype étudié. Voici un exemple d'analyse des effets des BLEs statine sur les cellules à l'aide du macro hypoténuse. Alors que 25 % des cellules témoins étaient effondrées, ce pourcentage a triplé pour atteindre 75 % chez les cellules traitées avec 5 µM de BLEs statine, reflétant l'affaiblissement du réseau contractile d'actinine.

Après avoir visionné ceci, vous devriez maintenant bien comprendre comment les motifs micro-adhésifs permettent de surmonter plusieurs goulots d'étranglement dans l'analyse à haut contenu. Premièrement, l'utilisation de motifs micro-adhésifs rend l'acquisition, le traitement et l'analyse des images nettement plus simples. Deuxièmement, les motifs micro-adhésifs permettent de détecter des effets très subtils des médicaments à de très faibles doses, car ils réduisent la variabilité d'une cellule à l'autre en normalisant leur morphologie et leur comportement.

Et enfin, par rapport aux milliers de cellules habituellement nécessaires pour obtenir un bon résultat en analyse cellulaire, vous n'avez besoin que de quelques dizaines de cellules pour obtenir un résultat robuste et significatif en utilisant notre cellule de référence.