Méthodes de transfert rapide et la localisation des agents pathogènes dans l'intestin de Lyme Tick

L'objectif général de cette procédure est d'injecter par microinjection et de localiser des cellules de Borrelia burgdorferi dans l'intestin du tique. Cela est réalisé en préparant d'abord des aiguilles capillaires en verre et en les remplissant avec des cellules de B. burgdorferi. Ensuite, les cellules de B. burgdorferi sont transférées dans l'intestin du tique par microinjection.

La tique est ensuite disséquée et les tissus intestinaux sont retirés. Enfin, un marquage par immunofluorescence de beberg defer dans l'intestin de la tique est réalisé. En définitive, des résultats peuvent être obtenus qui démontrent la localisation de beberg à ferry dans l'intestin de la tique à l'aide de la microscopie confocale.

Bonjour, je suis le Dr Ruth Paul Paul, professeure adjointe à l'Université du Maryland, au Département de médecine vétérinaire. Aujourd'hui, deux membres de mon laboratoire, Toro Cairo, chercheur postdoctoral, et Adam Coleman, étudiant diplômé, vont vous montrer la procédure d'infection artificielle de tiques par microinjection que nous réalisons couramment en laboratoire. Après la microinjection, nous disséquerons la tique et visualiserons les bactéries dans l'intestin de la tique à l'aide d'un microscope confocal CE.

Le principal avantage de la microinjection chez les tiques pour obtenir une génération de tiques naturellement infectées réside dans la durée de la procédure. La microinjection réduit considérablement l'ensemble du processus, passant de plusieurs semaines à quelques heures, car environ cinq semaines sont nécessaires pour produire des tiques infectées par le biais du processus naturel de repas sanguin. Cette technique peut également être adaptée pour injecter d'autres réactifs utiles, tels que des ARN double brin destinés à l'interférence par ARN (ARNi) ou des antisérums permettant une inhibition spécifique des anticorps à l'intérieur de la tique.

Pour commencer, fabriquez plusieurs aiguilles de microinjection en chauffant et tirant des capillaires en verre d'un millimètre de diamètre dans un appareil de tirage de micropipettes en verre. Retirez soigneusement les capillaires fragiles. Conservez les aiguilles rassemblées avec la pointe orientée vers le haut sur du ruban adhésif dans une boîte de Pétri.

Ensuite, cultiver B. burgdorferi dans du milieu BSK jusqu'à une concentration d'environ 107 cellules par millilitre. Pelletiser B. burgdorferi par centrifugation à 3000 × g pendant 10 minutes à température ambiante. Retirer le surnageant et resuspendre complètement le culot dans du milieu BSK en passant doucement la suspension à travers une micro-pipette stérile de 200 microlitres, afin d'obtenir une concentration finale de 109 cellules par millilitre.

Étant donné que les cellules sont resuspendues à une densité élevée et pourraient s'agglomérer, la suspension cellulaire doit être utilisée immédiatement pour la microinjection afin de préparer les tiques. Placez un ruban adhésif double face transparent sur une lame en verre en travaillant sur un tapis adhésif, retirez soigneusement les tiques du récipient. À l’aide d’un petit pinceau, disposez le nombre requis de tiques à injecter sur le ruban adhésif, côté ventral vers le haut, orientées dans la même direction. Chargez cinq microlitres de la culture de beberg de ferry dans l’aiguille capillaire regroupée. À l’aide d’une pipette de 20 microlitres munie d’une pointe microcharge, vérifiez la présence de bulles d’air piégées dans l’aiguille et rechargez l’aiguille avec la culture bactérienne.

Si nécessaire, observer la tique au microscope binoculaire de dissection et focaliser sur la zone de l'orifice anal de la tique. Toucher délicatement l'extrémité de l'aiguille capillaire afin de casser le tube là où son diamètre est légèrement inférieur à celui de l'orifice anal de la tique, formant ainsi l'aiguille de microinjection. Cette étape est cruciale, car toute tentative d'injection de tiques avec des extrémités d'aiguilles inappropriées provoque des lésions et éventuellement la mort.

Au niveau de la tique injectée. Placer les tiques immobilisées sous le microscope stéréoscopique et focaliser sur l'orifice anal, recouvert par deux plaques anales mobiles. À l'aide de pinces fines, toucher délicatement et appliquer une très légère pression sur n'importe quelle zone située près de l'orifice anal.

Cela permettra de séparer les plaques anales et d'ouvrir le pore anal qui communique avec l'intestin. Insérez délicatement la pointe de l'aiguille légèrement dans l'ouverture anale à travers l'écartement forcé des plaques anales. L'insertion de l'aiguille doit être minimale, car la pointe en verre pourrait endommager l'intestin postérieur semi-transparent qui se rattache au rectum.

À l’aide d’un microinjecteur équipé d’une commande automatique au pied, injectez la solution de beberg de ferry en utilisant les paramètres suivants : une pression d’injection de 1000 hectopascals, un temps d’injection de 0,2 seconde et une pression de compensation de huit hectopascals. Chaque puce reçoit une injection unique après la microinjection.

La tique doit présenter des signes de mouvement ou ramper en réponse à des stimuli, comme avant l'injection. Pour disséquer les tiques en vue d'une microscopie en immunofluorescence, déposez d'abord une goutte de solution saline tamponnée au phosphate sur une lame en verre propre destinée à la dissection, et une autre sur une lame recouverte de poly-L-lysine. Pour la microscopie, préparez une autre lame en verre avec du ruban adhésif double face. Ensuite, retirez la tique du récipient et placez-la sur le ruban adhésif double face.

À l’aide d’un petit pinceau sous le microscope stéréoscopique, observez et focalisez sur la tique. Placez une lame de rasoir bien aiguisée sur la tique entre la première et la deuxième paire de pattes. Appuyez fermement pour couper la tique en deux morceaux, puis immergez immédiatement l’abdomen dans une goutte de PBS à l’aide de pinces fines. Saisissez l’exosquelette dorsal et ventral autour du site de la coupure.

Retirer délicatement le bouclier dorsal en l'écartant du tique afin d'exposer le diverticule intestinal de couleur brunâtre. Veiller à maintenir les tiques en cours de dissection immergées dans le PBS en tout temps. Les faisceaux de glandes salivaires, semi-translucides, sont situés de chaque côté de la région antérieure de l'intestin et peuvent être retirés à ce stade si désiré.

En maintenant l'exosquelette restant en place avec des pinces, retirez délicatement l'intestin de l'abdomen. Nettoyez soigneusement l'intestin en éliminant tous les tissus piégés, comme les trachées. À l'aide de la pointe de pinces fines, transférez rapidement l'intestin de la tique dans une goutte de PBS sur une lame en verre recouverte de poly-L-lysine.

Séparez l'intestin en morceaux plus petits à l'aide de lames fines ou en appuyant délicatement avec la pointe de pinces fines. Aspirez soigneusement l'excès de PBS autour des tissus intestinaux. Laissez les tissus intestinaux sécher à l'air à température ambiante.

Fixer l'intestin de la tique en l'immergeant dans de l'acétone pendant 10 minutes. Laisser sécher à l'air à température ambiante ; les lames peuvent être conservées à cette étape pendant plusieurs mois à moins 20 degrés Celsius dans un récipient hermétique. Pour le marquage immunofluorescent de l'intestin, tracer un cercle autour de l'intestin de la tique fixé à l'aide d'un stylo pap ou d'un autre dispositif formant une barrière hydrophobe.

Cela aidera à retenir les solutions de coloration lors des étapes d'incubation ultérieures. Recouvrez l'intestin de la tique d'une ou plusieurs gouttes de tampon de blocage pendant 30 minutes, à température ambiante.

Le sérum utilisé pour le blocage dépend de l'origine animale de l'anticorps. Ne laissez pas sécher la lame à partir de ce stade. Aspirez lentement le tampon de blocage.

Incuber l'intestin avec des solutions d'anticorps primaires et/ou secondaires appropriées. Nous utilisons un anticorps anti-B berg marqué par la fluorescéine, l'isothiocyanate ou FXI. Diluer l'anticorps au 1/100 dans du tampon de blocage pendant une heure.

À température ambiante, couvrez le récipient avec du papier d'aluminium pour limiter l'exposition à la lumière. Éliminez la solution d'anticorps par aspiration douce. Incubez l'intestin avec un colorant fluorescent pour marquer les tissus de la tique, tels que le DPI ou l'iodure de propidium.

Nous utilisons habituellement 20 microgrammes par millilitre de iodure de propidium dans du PBS pendant cinq minutes à température ambiante, puis nous lavons trois fois avec du PBS contenant 0,05 % de Tween 20 pendant cinq minutes. Enfin, nous montons la lame dans du glycérol tamponné contenant un réactif Antifa et la recouvrons soigneusement d'une lamelle en verre. Les lames peuvent être conservées à cette étape pendant plusieurs mois à quatre degrés Celsius dans un récipient hermétique, puis observées et localisées par microscopie confocale.

Une microinjection chez une tique est montrée ici avec une pipette remplie de bleu brillant kumasi pour une meilleure visibilité. Des pinces fines sont utilisées pour appliquer une pression douce sur le corps, permettant ainsi la séparation des plaques anales et l'ouverture du pore anal en vue de la microinjection. Ici, la région antérieure d'un diverticule intestinal est montrée avec du beberg ferry à l'intérieur de l'intestin.

Les noyaux intestinaux et les spirochètes sont marqués respectivement par l'iodure de propidium ou un anticorps anti-Beberg Ferry conjugué à la Fitzy. Une fois la technique maîtrisée, nous avons constaté qu'il est possible de micro-injecter 10 tiques, produisant naturellement environ cent mille tiques survivantes infectées par Fer. Bien que les tiques puissent être utilisées immédiatement pour d'autres expériences, nous attendons généralement un ou deux jours pour nous assurer qu'elles survivent à la procédure avant de poursuivre.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment générer des tiques artificiellement infectées par microinjection et barrière localisée à l’aide de flux immuno-confocaux. Travailler avec des tiques et de fines aiguilles en verre remplies d’un agent pathogène humain, comme Borrelia burgdorferi, peut présenter des risques. Soyez attentif à l'emplacement des tiques et des aiguilles, et appliquez en permanence les précautions de niveau de biosécurité 2.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.