Analyse de Microarray pour Saccharomyces cerevisiae

L'objectif général de cette procédure est d'initier les étudiants universitaires en sciences à la technologie des puces à ADN en examinant les différences d'expression chez des levures subissant un stress oxydatif. Cela est réalisé en isolant d'abord l'ARN total à partir de cultures de levures traitées avec du peroxyde d'hydrogène et des témoins non traités. La deuxième étape de la procédure consiste à produire et purifier de l'ADNc à partir de ces échantillons d'ARN.

L'ADNc est ensuite utilisé pour préparer des ARNc marqués par la biotine par transcription in vitro. La dernière étape de la procédure consiste en la fragmentation des ARNc marqués par la biotine afin de permettre leur hybridation avec les puces à gènes de levure AFI metrics. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus, montrant les différences d'expression entre les deux échantillons de levure et démontrant, grâce à la bioinformatique, la puissance de l'analyse par puces à ADN aux étudiants en licence.

L'équipe de vulgarisation du réseau génétique du Vermont a eu pour la première fois l'idée de cette méthode lorsqu'elle a été chargée de dispenser la technologie microray aux étudiants en sciences dans tout l'État du Vermont afin d'améliorer leur enseignement scientifique. À ce jour, cette méthode a été dispensée dans plusieurs sites répartis sur huit collèges universitaires de l'État. Ainsi, le principal avantage de l'utilisation de microray dans des modules pédagogiques est qu'elle nous permet d'enseigner des techniques générales de biologie moléculaire, utilisées quotidiennement en laboratoire, à un groupe d'individus.

Nous pouvons également utiliser cela pour enseigner aux étudiants et aux enseignants, ainsi qu’à nos groupes. En effet, nous avons des étudiants et des professeurs qui travaillent ensemble sur le même projet. Ils apprennent certaines techniques nécessitant une grande habileté, comme la manipulation de l’ARN, une tâche loin d’être facile.

Ils apprennent à précipiter l'ADN à l'aide de réactifs de visualisation. Ils utilisent effectivement les techniques qu'ils rencontreront lors de leurs études supérieures ou dans les laboratoires de biologie moléculaire au quotidien. Bien que cette méthode convienne pour étudier le stress oxydatif et la levure, elle s'applique certainement à d'autres organismes modèles et à d'autres systèmes biologiques que vous souhaiterez examiner.

Les modifications de l'expression des gènes, qu'elles soient associées à des changements développementaux, à des toxines environnementales, à des états pathologiques spécifiques ou à de nombreux autres facteurs, sont fréquentes. Pour examiner les différences d'expression chez la levure subissant un stress oxydatif, l'ARN total est d'abord extrait de deux cultures de levures par lyse enzymatique. Une culture a été exposée à un stress oxydatif par un traitement d'une heure avec du peroxyde d'hydrogène 0,5 millimolaire dans une solution saline tamponnée au hank's, tandis que l'autre culture a été traitée uniquement avec du HBSS comme témoin.

Commencez par étiqueter deux tubes de microcentrifugeuse de 1,7 millilitre avec les informations d'identification appropriées. Transférez 1,5 millilitre de la culture de levure appropriée dans chaque tube. Centrifugez les tubes à 5 000 g pendant deux minutes à température ambiante.

Après la centrifugation, utilisez une micropipette pour retirer soigneusement et jeter le surnageant sans perturber le culot. Vérifiez que le culot est suffisamment important avant de poursuivre la procédure. Si le culot est trop petit, ajoutez 1,5 millilitre de culture dans le même tube contenant le culot, puis centrifugez pour obtenir un culot plus important.

Jetez le surnageant à l’aide d’une micropipette, en éliminant autant que possible le liquide du culot de levures. Ajoutez ensuite 100 microlitres de tampon SG et 30 microlitres de solution de lyase au culot de levures, puis vortexez pour homogénéiser. Incubez les deux tubes pendant 30 minutes à température ambiante pendant l’incubation.

Faites tourner doucement chaque tube toutes les 10 minutes pour générer des plats. L'une des étapes les plus critiques lorsque vous effectuez un enrobage sphérique de levures consiste à vous assurer que vous avez bien obtenu 100 % de plast sphérique après le traitement. Cela signifie que toutes les enzymes lytiques ne se valent pas.

Vous devez donc vérifier que l'enzyme lytique de bonne qualité vous donne un bon enrobage sphérique, ce qui signifie que vous devez prélever ces échantillons, les déposer sur une lame de microscope et les examiner au microscope après ajout de SDS à 0,1 % afin de vous assurer de la formation de protoplastes. Pour observer un enrobage sphérique complet, pipetez 10 microlitres de l'échantillon de levure sur une lame de microscope tout en examinant l'échantillons au microscope avec un microlitre de SDS à 0,1 % afin de provoquer le gonflement des cellules de levure et la formation de sphères ou de sphéroïdes parfaits. Il est important d'observer que les cellules en bourgeonnement forment également des sphéroïdes en S.

Si un plaquage sphéro partiel est observé, un traitement prolongé avec la lyase est recommandé. Une fois le plaquage sphéro complet confirmé, ajouter 350 microlitres de tampon BRLT dans chaque tube, puis ajouter 250 microlitres d'éthanol à 100 %. S'assurer que le tube est bien fermé en maintenant le couvercle fermé et vortexer vigoureusement pendant une minute.

Cette procédure permettra de lyser les plaques Sphero. Ensuite, utilisez les colonnes de spin R et easy Z pour recueillir et purifier l'ARN à partir des deux cultures. Enfin, évaluez la qualité de l'ARN extrait à l'aide d'un gel d'agarose préformé à 1,2 % en électrophorèse afin de préparer l'ARNc marqué à la biotine.

L'ARN total extrait des cellules de levure est d'abord utilisé pour synthétiser l'ADNc par transcription inverse. Après la génération de l'ADNc, préparez les tubes contenant le gel de verrouillage de phase pour leur utilisation dans la précipitation de l'ADNc : centrifugez les tubes contenant le gel de verrouillage de phase à vitesse maximale pendant une minute afin de s'assurer que le gel se trouve bien au fond du tube. N'agitez pas les tubes par vortex pour précipiter l'ADNc ; pipetez 162 microlitres de la couche inférieure d'un mélange phénol-chloroforme isoamylique tamponné au Tris à pH 8,0, ou mélange PCI, puis ajoutez-les au contenu de 162 microlitres du tube de réaction de synthèse du brin complémentaire d'ADNc. Des volumes égaux de phases aqueuse et organique sont requis pour cette étape.

Vortexez pendant cinq secondes pour mélanger le contenu. Ensuite, utilisez une micropipette pour transférer l'ensemble du mélange CD N-A-P-C-I dans le tube contenant le gel de verrouillage de phase. N'effectuez pas de vortex sur le tube de gel de verrouillage de phase ; centrifugez à vitesse maximale pendant deux minutes.

Ensuite, utilisez une micropipette pour transférer la couche supérieure du tube contenant le gel de verrouillage de phase vers un nouveau tube de 1,7 millilitre récemment étiqueté. Essayez de récupérer autant que possible de cette couche. Ajoutez au tube microcentrifuge de 1,7 millilitre : 405 microlitres d'éthanol à 100 %, 80 microlitres d'acétate d'ammonium et un microlitre de colorant de culot, puis vortexez.

Placer brièvement le tube dans la centrifugeuse, la charnière du tube orientée vers l'extérieur, et centrifuger à vitesse maximale pendant 20 minutes. À température ambiante, une fois la centrifugation terminée, retirer délicatement le tube de la centrifugeuse en prenant soin de ne pas perturber le culot d'ADN. Le culot doit être rose en raison de la couleur du marqueur et d'une taille approximative d'un grain de sel.

Et sur le côté du tube, sous la charnière, placez le culot d'ADN sur de la glace et passez immédiatement au nettoyage du culot. Pour commencer la procédure de nettoyage du culot d'ADN, utilisez une micropipette P1000 pour retirer soigneusement tout le surnageant du tube. Veillez à ne pas perturber le culot.

Il s'agit de votre échantillon de 500 microlitres d'éthanol froid à 80 % ajouté dans le tube. Fermez délicatement le tube et retournez-le lentement plusieurs fois. Surveillez très attentivement votre culot pour vous assurer qu'il ne se détache pas de la paroi du tube.

Si le culot se détache, vous pouvez le faire revenir au fond du tube en replaçant le tube dans le porte-échantillons et en laissant le culot se déposer au fond, ou en centrifugeant le tube à vitesse maximale pendant 15 secondes. Ensuite, utilisez une micropipette P1000 pour retirer soigneusement l'éthanol sans perturber le culot. Inclinez le tube afin de permettre le retrait de la plus grande quantité possible de liquide.

Ajoutez une nouvelle éloquation de froid, 80 % d'éthanol, fermez le tube et retournez-le lentement plusieurs fois. Après avoir retiré tout l'éthanol possible à l'aide d'une micropipette P1000, centrifugez le tube à vitesse maximale pendant cinq secondes.

Ensuite, utilisez une micropipette P 10 pour éliminer les derniers microlitres d'éthanol sans perturber le culot. Placez le tube ouvert dans une boîte de séchage pendant 10 à 20 minutes afin d'évaporer l'éthanol résiduel. Le culot peut facilement être perdu une fois sec ; manipulez donc le tube avec précaution et refermez bien le bouchon.

Lorsque le séchage est terminé, visualisez le culot sec pour confirmer sa présence dans le tube. Enfin, remettez en suspension le culot sec dans 22 microlitres d'eau sans ARN et placez le tube sur de la glace. Ce CDNA est ensuite utilisé pour préparer du CRNA marqué à la biotine par transcription in vitro à l'aide du kit Enzo BioArray.

Une fois que l'ARNc marqué à la biotine a été purifié et quantifié, il est fragmenté pour la préparation de la cible. Après la génération de l'ADNc, nous utilisons une méthodologie standard de transcription in vitro afin de produire de l'ARNc biotinylé. L'ARNc doit subir une fragmentation avant d'être appliqué sur la puce à microarray.

Pour commencer cette procédure, transférez une quantité équivalente à cinq microgrammes d'ARNc dans un tube PCR de 0,5 millilitre étiqueté. Ajoutez suffisamment d'eau exempte d'ARNs pour porter le volume total à 16 microlitres, puis ajoutez quatre microlitres de tampon de fragmentation 5 x dans le tube. Le volume total dans le tube doit être de 20 microlitres.

Vortexez le tube et centrifugez pendant 10 secondes. Incubez ensuite le tube à 94 degrés Celsius pendant 30 minutes. Dans un thermocycleur, placez le tube sur de la glace après l'incubation.

L'ARNc fragmenté et non fragmenté de chaque échantillon est ensuite évalué par électrophorèse en utilisant un gel AROS préfabriqué à 1,2 %. Une fois la course terminée, le gel est visualisé sur un transilluminateur et une image est acquise. Le produit final de synthèse est hybridé sur des puces génétiques de levure atric, et des résultats représentatifs de l'analyse par puces à ADN sont présentés ici.

Cette première figure est un exemple d'image scannée d'une puce à gènes de levure atrics générée par le logiciel de fonctionnement de la puce à gènes atrics. Il s'agit d'un nuage de points en deux dimensions représentant tous les transcrits génétiques, soit environ 6 700 gènes, comparant les données de levure témoins et traitées. Chaque point représente un gène unique.

Les gènes colorés en violet indiquent des gènes qui sont exprimés de manière différentielle, tandis que les gènes colorés en rouge ne le sont pas. Dans cet exemple, la majorité des gènes exprimés de manière différentielle sont ceux impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire, comme l'indiquent leurs descriptions. Ce diagramme en organigramme provenant de la base de données pour la visualisation des annotations et la découverte intégrée illustre les gènes exprimés de manière différentielle dans une voie biologique affectée.

Les gènes indiqués par une étoile rouge indiquent les gènes sous-régulés dans la voie mitotique. Enfin, des résultats représentatifs d'un graphique en volcan, généré à l'aide du logiciel Geo Species Gene Sifter, sont présentés ici. Les échantillons témoins et traités ont été comparés avec un seuil de valeur P de 0,05 et un seuil de changement d'expression de 1,5 fois.

Nous avons choisi d'utiliser la levure car elle est facile à cultiver rapidement, mais nous nous sommes également rendu compte que la partie la plus critique du travail avec la levure consiste en réalité à réaliser une sphéroplastation adéquate. L'une des choses que nous souhaitons éviter en microarray est une digestion incomplète, qui aboutirait à sphéroplaster uniquement les cellules se trouvant en phase G1 ou en phase G2/M. Ainsi, vous mèneriez une expérience de microarray sur des levures se trouvant à une phase de réplication spécifique.

Un autre point complexe que nous cherchons à souligner dans cet exercice est que la centrifugation de l'ADN, dont les gens parlent tous les jours, n'est pas nécessairement facile. Ce que nous avons fait dans notre module, c'est utiliser des tubes spécialisés et des réactifs de visualisation. Ainsi, nous pouvons effectivement faire précipiter l'ADN et visualiser le culot, ce qui le rend plus accessible aussi bien pour les élèves que pour les enseignants.

Afin qu'il puisse être utilisé à toutes les étapes des travaux sur l'ADN et l'ARN après son développement. Ce module a vraiment ouvert la voie aux enseignants des instituts de premier cycle universitaire pour explorer, éventuellement, d'autres organismes modèles ou d'autres protocoles de traitement compatibles avec les programmes existants ou peut-être avec leurs propres centres d'intérêt en recherche. Pour vous donner un exemple de certaines des modifications apportées, un site a examiné les effets d'un traitement herbicide sur la levure, un autre a étudié le traitement par LAMP IDE chez la levure, tandis qu'un autre site s'est intéressé aux changements développementaux dans une lignée cellulaire de mammifère qui les intéressait particulièrement.

Enfin, un autre site avait examiné l'impact de sources lumineuses différentes sur l'arabidopsis ou les plantes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de mettre en place une expérience de microrayonnement avec des étudiants en sciences du premier cycle, y compris l'isolement d'ARN total à partir de levures, la génération d'ADNc et la fragmentation d'ARNc marqué à la biotine. Des expériences pratiques avec des technologies de ce niveau contribuent à renforcer et à consolider l'enseignement des sciences au premier cycle.