Ion Beam ciblée de fraisage et de microscopie électronique à balayage du tissu cérébral

L'objectif de cette procédure est d'acquérir des images en série à travers une région spécifique d'un tissu cérébral à l'aide d'un microscope électronique à balayage équipé d'un faisceau d'ions focalisés. Cette acquisition est réalisée en découpant d'abord le cerveau en tranches qui sont ensuite contrastées et incluses dans une résine. La deuxième étape consiste à prélever la région d'intérêt à partir de la section cérébrale incluse et à la monter sur un bloc de résine vierge.

La troisième étape consiste à tailler le bloc de résine à l'aide d'un ultramicrotome et à utiliser le faisceau d'ions du microscope pour isoler uniquement la région à imager. L'étape finale consiste à acquérir en série des images d'une face du bloc de résine en utilisant le faisceau d'ions pour retirer de façon répétée des couches fines avant chaque prise d'image. En définitive, des résultats peuvent être obtenus qui montrent des images en série à travers une région d'intérêt.

La série d'images est collectée automatiquement et le jeu de données comporte généralement des voxels isotropes, ce qui permet d'observer les structures de l'image sous n'importe quel angle dans la pile. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la microscopie électronique en transmission sur sections séries, est qu'elle permet d'atteindre une résolution en Z nettement supérieure. Par ailleurs, comparée à la tomographie électronique, elle permet d'imaginer des volumes beaucoup plus grands avec une résolution optimale pour les échantillons inclus en résine.

La procédure commence par la dissection du cerveau fixé d'un rat perfusé anesthésié. Incorporez le cerveau dans de l'aérosol à 5 % chaud dans un moule en plastique, orientez le cerveau selon l'angle correct avant que l'aérosol ne durcisse, puis fixez le bloc d'aérosol contenant le cerveau sur un porte-échantillon à l'aide d'une tranchanteuse vibrante. Découpez des sections coronales de 80 micromètres, en réalisant autant de sections que nécessaire pour inclure la région d'intérêt.

Placez ensuite les échantillons dans des vials en verre de 20 millilitres. Placez jusqu'à 10 sections par vial. Rincez les échantillons trois fois pendant cinq minutes chacun dans du tampon K coate 0,1 molaire.

Ensuite, colorer les échantillons avec du cyanure de potassium à 1,5 % et du tétraoxyde d'osmium à 1 % dans un tampon K coate 0,1 molaire pendant 30 minutes. Poursuivre la coloration des échantillons avec du tétraoxyde d'osmium à 1 % dans un tampon K coate 0,1 molaire pendant 30 minutes. Après cela, rincer une fois avec de l'eau doublement distillée pendant trois minutes, puis colorer avec de l'acétate d'aluminium à 1 % dans de l'eau doublement distillée pendant 30 minutes.

Ensuite, rincez les sections pendant cinq minutes dans de l'eau doublement distillée, puis déshydratez-les dans une série alcoolique progressive, en prévoyant deux minutes pour chaque changement. L'étape suivante consiste à inclure les sections dans des concentrations croissantes de résine Duran mélangée à de l'alcool, en laissant 30 minutes entre chaque changement. Commencez avec un mélange éthanol-résine de 50 à 50, puis passez à 30 à 70, ensuite à 10 à 90, et enfin immergez complètement les sections dans de la résine à 100 % pendant 30 minutes.

Ensuite, remplacez le milieu par de la résine Duran fraîche à 100 %. Agitez lentement pendant une heure sur le mélangeur rotatif. Après l'inclusion, utilisez un bâtonnet en bois pour placer les sections sur des lames de microscope en verre préalablement recouvertes d'agents de séparation de moule.

Placez autant de sections que possible sur les lames, mais veillez à ne pas surcharger les lames. Assurez-vous qu'une étiquette d'identification est également placée entre les lames de microscope. Placez les lames dans un four à 65 degrés Celsius pendant 24 heures.

Le lendemain, retirez les échantillons du four. Poussez délicatement une lame de rasoir entre les lames de verre pour microscopie et retirez la couche de résine contenant les échantillons située entre les lames, en tenant la couche de résine avec les doigts. Rincez délicatement l'échantillon à l'eau courante.

Pour éliminer tout agent de séparation des moules, placez l'échantillon sous un microscope stéréo avec éclairage transmis en utilisant un objectif de faible puissance. Marquez la région d'intérêt à l’aide d’une aiguille fine. Utilisez une lame de rasoir pour découper un petit carré de trois millimètres sur trois millimètres autour de la région d’intérêt.

Utilisez de la colle acrylique pour fixer le petit bloc de résine sur le dessus d'un bloc de résine vierge. Ensuite, serrez le bloc dans le porte-échantillon du microtome ultramince. En regardant à travers le microscope stéréo fixé, utilisez une lame de rasoir pour tailler autour de la région d'intérêt jusqu'à ce qu'il ne reste qu'une petite pyramide de matériau.

Coupez le bord du bloc près de la région d'intérêt selon un angle par rapport à la surface supérieure du bloc à l'aide d'un couteau en verre fixé au microtome ultramicrotome. Ajustez davantage le bloc afin que la région d'intérêt puisse être localisée précisément par rapport aux dimensions de la surface du bloc. Retirez le bloc du microtome ultramicrotome et placez-le sous un microscope à lumière transmise.

Photographiez la région d'intérêt. Utilisez une scie de bijoutier pour découper le bloc taillé et le séparer du reste du support en résine à l’aide de peinture au carbone. Fixez le bloc SA sur un porte-échantillon de MEB et orientez-le de manière à ce que la face à imager soit tournée vers le bord le plus externe.

Une fois la colle sèche, transférez la préparation vers un système d'évaporation sous vide en forme de croissant et recouvrez le bloc d'une fine couche d'or de plus de 20 nanomètres. Le bloc de tissu inclus dans la résine est désormais prêt à être observé au microscope électronique à balayage à faisceau d'ions focalisés. Insérez l'échantillon dans son porte-objet dans le microscope à faible grossissement et, à l'aide de l'imagerie par électrons secondaires, orientez le bloc de manière à ce que la région d'intérêt et le côté du bloc à observer soient bien face à l'appareil.

L'opérateur oriente le bloc de manière à ce que la face à imager soit parallèle au faisceau de fraisage. Cela positionne le faisceau d'électrons à un angle de 54 degrés par rapport à cette face, en utilisant un courant de faisceau d'ions compris entre 13 et 27 nanoampères, à 30 kilovolts.

Retirez une bande étroite de résine à l'avant de la région à imager. Ensuite, passez en mode d'imagerie d'électrons rétrodiffusés pour visualiser la surface usinée qui recouvre la région d'intérêt. À l'aide de l'image de référence en microscopie optique prise précédemment et de l'image de la surface usinée, localisez la région exacte du bloc à usiner et à imager à l'aide du système d'injection de gaz du microscope.

Déposez une couche protectrice d'environ un micron d'épaisseur en carbone ou en métal sur la surface du bloc au-dessus de la région d'intérêt en utilisant un courant de 700 picoampères. Enfin, fraisez la région du bloc dans laquelle les images finales seront prises. Laissez le faisceau de fraisage fraiser complètement cette face d’image jusqu’à ce qu’aucun artefact de fraisage ne soit visible sur la surface.

Sélectionnez les paramètres du microscope pour l’imagerie en série de la face. Les paramètres typiques sont des tensions comprises entre 1,2 et deux kilovolts, avec des tailles de pixel comprises entre quatre et 20 nanomètres. Le temps de séjour par pixel doit être d’environ 10 microsecondes afin que le temps total nécessaire pour usiner la face et acquérir une image soit inférieur à deux minutes.

Laisser le microscope reposer pendant au moins deux heures pour permettre toute stabilisation thermique. Pour dissiper les variations thermiques, commencer le processus de microtome ionique à faisceau focalisé (FIB) et d’imagerie afin d’acquérir des images en série à travers la région d’intérêt. Cette figure montre une image en électrons rétrodiffusés à contraste inversé de la surface du bloc, révélant l’ultrastructure au sein d’une région du cerveau enveloppé.

Toutes les membranes sont visibles, ainsi que les grandes structures macromoléculaires. Cette figure est composée d'un total de 1 600 images recueillies avec un espacement de cinq nanomètres, ce qui donne un empilement d'images avec des voxels isotropes. Cet empilement peut être imagé dans n'importe quel plan avec la même résolution.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation des tissus cérébraux pour l'imagerie en série à l'aide du microscope électronique à balayage par faisceau focalisé.