Fabrication d'un dispositif microfluidique pour la compartimentation du Neuron Soma et des axones

Bienvenue dans le laboratoire du Dr Newly John. Le laboratoire John se spécialise dans la conception de plates-formes microfluidiques pour des applications biologiques. Dans cette vidéo, nous démontrerons la fabrication et l'utilisation d'un dispositif microfluidique conçu pour compartimenter et cultiver des neurones primaires.

Le dispositif neuronal a été publié pour la première fois dans Nature Methods en août 2005. Depuis son introduction, le dispositif neuronal est largement utilisé par des collaborateurs du monde entier. Le dispositif neuronal est constitué d'un morceau de PDMS moulé sur une tranche de silicium contenant un motif SUA du dispositif, créé précédemment par photolithographie.

L'appareil possède trois caractéristiques principales, quatre réservoirs de huit millimètres de diamètre, deux canaux principaux de 1,5 millimètre de large chacun, sept millimètres de long et cent microns de hauteur, ainsi que des micro-gorges de 10 micromètres de largeur et de trois micromètres de hauteur, qui relient les deux canaux principaux. La longueur des micro-gorges peut varier de 150 microns à 900 microns, bien que la longueur standard choisie soit de 450 microns. En observant l'appareil de manière à ce que les canaux principaux et les micro-gorges soient verticaux, on constate que les réservoirs situés à gauche des gorges sont reliés par les canaux principaux, tout comme les réservoirs situés à droite.

Cette caractéristique permet à un liquide de circuler à travers le canal principal, une fonction importante qui rend possible le chargement des cellules et le changement de milieu. Le dispositif neuronal présente trois avantages majeurs par rapport aux plates-formes traditionnelles de culture tissulaire. Premièrement, il permet la compartimentation séparée des corps cellulaires, ou somas, et des axones. Grâce au dispositif neuronal, il est possible d'obtenir des fractions axonales pures.

La taille et la longueur des microsillons permettent aux axones de traverser l'autre canal principal tout en empêchant les corps cellulaires de passer de l'autre côté. Deuxièmement, grâce à la conception du dispositif et à l'exploitation de la pression hydrostatique, il est possible de soumettre séparément soit le côté cellulaire, soit le côté axonal du dispositif à des traitements distincts, simplement en maintenant un volume plus élevé dans les réservoirs d'un côté du dispositif par rapport à l'autre. Et troisièmement, la fraction pure d'axones du dispositif peut être prélevée par aspiration sous vide, permettant au chercheur d'étudier et d'observer la régénération axonale.

La chercheuse Hina Lee va maintenant démontrer la préparation du dispositif microfluidique pour neurones. Un wafer de silicium de trois pouces comportant un motif en SU-8, réalisé par photolithographie, est utilisé pour mouler le moule microfluidique en polydiméthylsiloxane (PDMS). Nous désignons le wafer de silicium avec motif en SU-8 par les termes « moules maîtres » ou simplement « maîtres ».

Le PDMS est mélangé avec l'agent de réticulation selon un rapport massique de 10 à 1. Autrement dit, par exemple, 15 grammes de PDMS pour 1,5 gramme d'agent de réticulation. Le PDMS est ensuite bien mélangé et versé sur la tranche de silicium.

La plaquette de silicium est placée dans une boîte de Pétri en polystyrène de 10 centimètres de diamètre. Il faut environ 12 à 15 grammes de PDMS pour recouvrir les MA d'une épaisseur d'environ quatre millimètres. Le moule avec le PDMS est ensuite placé dans un dessiccateur sous vide, le couvercle de la boîte de Pétri étant retiré, puis le vide est appliqué.

Cela permet d'éliminer les bulles d'air du PDMS qui ont été introduites lors du mélange de l'agent de réticulation. Environ 15 minutes sont nécessaires pour éliminer les bulles d'air. Le moule avec le PDMS est retiré du dessiccateur après 15 minutes passées dans le dessiccateur sous vide.

Il reste encore quelques bulles sur le moule en PDMS. Un pistolet à air équipé d'un filtre de 0,45 micron est utilisé pour éliminer les bulles résiduelles. Le moule est ensuite placé sur une plaque chauffante à 80 degrés pendant une heure pour permettre la polymérisation.

Si un dessiccateur sous vide n'est pas disponible, le mélange peut être laissé à température ambiante pendant plusieurs heures. Les bulles d'air disparaîtront finalement d'elles-mêmes. En l'absence de plaque chauffante, le PDMS durcira à température ambiante après 24 heures.

Il est important de s'assurer que le modèle est à niveau pendant le processus de durcissement. Une fois que le PDMS est durci sur le modèle, il est transféré dans une hotte propre à l'aide d'une lame chirurgicale. Un cercle est découpé autour du périmètre des dispositifs.

Il est important, lorsqu'on insère la lame dans le PDMS pour établir le contact avec la plaquette de silicium, de ne pas exercer une pression excessive sur la plaquette, sans quoi le moule se fissurera avec une découpe circulaire entourant complètement les dispositifs. Il y a quatre dispositifs par moule en silicium de trois pouces. Le PDMS est délicatement soulevé du moule.

Cela peut être amorcé en tournant délicatement la lame chirurgicale lors de son insertion dans l'incision précédente. C'est très fin avec les dispositifs en PDMS sur le moule. Des réservoirs orientés vers le haut sont perforés dans le dispositif à l'aide d'un poinçon de biopsie tissulaire de huit millimètres.

Les débris restants dans le poinçon sont expulsés à l'aide d'une tige. Les dispositifs sont ensuite divisés en quatre et l'excès de PDMS est retiré afin que le dispositif s'ajuste parfaitement sur une couverture Corning. Un verre numéro un de 24 millimètres par 40 millimètres est utilisé avec de l'air azoté pour éliminer tout débris excédentaire.

Les débris tenaces peuvent également être éliminés à l'aide du ruban adhésif vinyle 3M Scotch Brand 4 7 1. Les dispositifs propres sont désormais prêts pour le collage au plasma. Un nettoyeur à plasma Herrick est utilisé pour lier brièvement les dispositifs à neurones aux lamelles de couverture.

Les dispositifs et les lamelles sont placés sur un plateau, puis le plateau est inséré dans le nettoyeur à plasma et une pompe à vide est utilisée pour évacuer l'air de la chambre. Il est important de noter que les dispositifs en PDMS sont placés face vers le haut, c'est-à-dire avec le côté du motif orienté vers le haut, afin qu'ils soient exposés au gaz de plasma.

Une fois que la pression sous vide a atteint 300 millitorr, l'alimentation du bobinage électrique est activée et réglée au maximum. On entrouvre légèrement la porte pour laisser entrer un peu d'air dans la chambre, ce qui aidera à générer le plasma. Les dispositifs et le verre de couverture sont traités au plasma pendant deux minutes.

Observez la couleur violette dans la chambre. C'est le plasma réel. La bobine électrique crée un plasma, qui est un gaz partiellement ionisé composé d'électrons, d'ions et d'atomes ou de molécules neutres.

Le plasma crée des espèces réactives à la surface du verre et du dispositif, qui, lorsqu'ils sont mis en contact, formeront une liaison permanente. Le plasma rend également la surface hydrophile, ce qui facilite l'ajout de liquides. Le nettoyeur à plasma stérilise également les dispositifs.

Après un traitement au plasma pendant deux minutes, l'alimentation sous vide est coupée et de l'air est introduit dans la chambre. Les surfaces traitées au plasma du verre et du dispositif microfluidique sont assemblées en contact l'une avec l'autre sur un banc propre. Les dispositifs sont ensuite placés dans des boîtes stériles de 60 millimètres.

Les surfaces traitées au plasma du verre et du dispositif forment une liaison étanche et irréversible. Dans les 10 minutes suivant la liaison au plasma, le dispositif reçoit du polyol lysine. Après 10 minutes, l'hydrophilie du dispositif diminue.

Il est difficile de faire entrer le PLL dans le dispositif. Il est important de vérifier la présence de bulles d'air dans le dispositif après l'ajout de PLL. Une méthode simple pour éliminer les bulles d'air présentes consiste à utiliser une pipette P 200 remplie de 100 microlitres de liquide.

Dans ce cas, le PLL place la pointe directement à l'ouverture du canal principal, puis appuie fermement sur le P 200. Cette manipulation peut devoir être répétée plusieurs fois, mais finalement la force du pipetage expulsera les bulles. Les dispositifs contenant le PLL sont laissés en incubation toute la nuit dans un incubateur standard pour culture tissulaire à 37 degrés avec 5 % de CO2.

Après 24 heures d'incubation avec le PLL, les dispositifs sont rincés deux fois rapidement avec de l'eau désionisée stérilisée au autoclave. Pendant ce processus, le liquide n'est jamais entièrement éliminé des canaux principaux, seulement des réservoirs. L'élimination du liquide des canaux principaux introduirait des bulles.

Après deux rinçages rapides, les dispositifs sont à nouveau remplis d'eau déionisée stérilisée au moyen de l'autoclave et replacés dans l'incubateur pendant au moins trois heures ou toute la nuit. Le lendemain, après avoir incubé les dispositifs dans l'eau pendant toute la nuit ou au minimum trois heures, ceux-ci sont de nouveau transférés dans la hotte de sécurité biologique et rincés deux fois avec de l'eau déionisée. Ensuite, le milieu basal neural contenant les suppléments nécessaires, B 27 et du glutamate, destiné à la culture de neurones primaires de rat, est ajouté aux dispositifs.

Les dispositifs sont ensuite replacés dans l'incubateur en vue d'une utilisation ultérieure. Les dispositifs sont désormais prêts à recevoir les neurones. Dans cette vidéo, nous avons démontré la technique de lithographie douce, que nous utilisons pour fabriquer nos dispositifs neuronaux.

Ces dispositifs peuvent être utilisés pour cultiver des neurones et d'autres types cellulaires d'intérêt. Le principal avantage de ces dispositifs réside dans la possibilité de séparer et de compartimenter la culture des corps cellulaires neuronaux d'une part, et d'une fraction pure d'axones d'autre part. Dans la prochaine vidéo, nous vous montrerons comment nous préparons des neurones corticaux fœtaux de rat à E 18 et comment nous chargeons les cellules dans le dispositif.

Voilà tout pour aujourd'hui depuis le laboratoire de John. Merci d'avoir regardé.