Une procédure de 1,5 heure pour l'identification des Enterococcus Espèces directement à partir d'hémocultures
10 février 2011
Un protocole rapide pour l'identification directe de Enterococcus faecalis et Enterococcus autre d'une hémoculture positive en utilisant un acide nucléique peptidique fluorescentes test d'hybridation in situ (FISH ANP).
L'objectif général de cette procédure est d'identifier rapidement les espèces d'entérocoques à partir de bouteilles de culture sanguine positives en utilisant une hybridation fluorescente par acide nucléique peptidique et C deux. Une fois les cultures sanguines préparées et testées au Gram pour confirmer la présence d'entérocoques en culture, les échantillons sont fixés sur des lames de microscope PNA FISH. Les lames sont ensuite incubées avec des sondes PNA spécifiques aux organismes d'intérêt.
Une fois que les sondes se sont hybridées, des lavages rigoureux sont effectués pour éliminer l'excès de sonde non hybridée. Un milieu de montage est ajouté sur les lames, qui sont ensuite scellées avec des lamelles. Les espèces d'entérocoques présentes dans l'échantillon peuvent être identifiées par microscopie à fluorescence.
Ce protocole d'identification PNA Fish est unique en offrant une méthode rapide et spécifique pour l'identification d'entérocoques provenant d'une paralysie. Incubez deux flacons d'hémoculture, un aérobie et un anaérobie contenant du sang veineux prélevé sur un patient suspecté de sepsis, dans un appareil automatisé d'hémoculture à 35 degrés Celsius. Dès que l'appareil indique avoir détecté une croissance microbienne, retirez le flacon et remuez doucement les flacons d'hémoculture afin de resuspendre uniformément les bactéries.
Ensuite, à l’aide d’une seringue stérile et d’une aiguille, transférer aseptiquement environ cinq millilitres de sang de chaque flacon dans un tube séparé à bouchon vissé. Une fois que tous les échantillons ont été répartis, utiliser une pipette stérile pour transférer une goutte de sang de chaque tube sur une lame de microscope en verre distincte. Laisser sécher la lame à l’air pendant environ 15 minutes.
Ensuite, une fois que la lame est complètement sèche, plongez-la dans du méthanol pour fixer l'échantillon. Après la fixation des lames, rincez-les et réalisez une coloration de Gram standard afin de déterminer la morphologie des organismes présents dans chaque hémoculture. Examinez les lames colorées au microscope à l'aide d'un objectif à immersion huileuse.
Saisir une espèce de caucase apparaîtra sous forme de coques gram-positifs généralement assemblés en paires ou en courtes chaînes. Déposer une goutte de solution de fixation dans la cavité d'une lame de microscope à poissons. Mélanger doucement le tube de culture sanguine à tester.
Ensuite, transférez 10 microlitres de culture sur la goutte de solution de fixation et aspirez et expulsez plusieurs fois pour émulsifier l'échantillon. Placez les lames sur une plaque chauffante à 55 degrés Celsius pendant 20 minutes afin de fixer les frottis pour chaque test. Veillez à inclure des lames témoins positives et négatives pour l'évaluation de la qualité du dosage.
Des lames-témoins de calus peuvent être achetées auprès d'un fournisseur Van DX ou préparées à l'aide de cultures de référence. Une fois la frottis prêt, déposer une goutte de EFI calus O-E-P-N-A dans la cavité contenant l'échantillon de culture sanguine, ainsi que dans les cavités témoins positive et négative. Afin d'éviter toute contamination de la solution mère de la sonde, veiller à ne pas laisser la pointe du compte-gouttes toucher le frottis sanguin.
Placez une lame couvre-objet sur l'échantillon en prenant soin de ne pas créer de bulles d'air. Incubez ensuite la lame sur un bloc chauffant à 55 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pour permettre l'hybridation de la PNA après l'incubation, placez les lames dans un porte-lame.
Immerger le porte-lame chargé dans une boîte de coloration contenant de la solution de lavage préchauffée à 55 degrés Celsius. Pour éliminer l'excès de PNA présent sur l'échantillon, retirer délicatement la lamelle en agitant la lame dans le tampon ou à l’aide de pinces. Incuber la lame à 55 degrés Celsius dans la solution de lavage pendant 30 minutes.
Ensuite, retirez la lame du bac de coloration et laissez-la sécher à l'air libre. Une fois la lame sèche, ajoutez une goutte de milieu de montage à température ambiante sur la lame et posez délicatement une lamelle sur l'échantillon. Examinez les lames au microscope à fluorescence en utilisant un filtre double bande dans les deux heures suivant la préparation.
Grâce à cette méthode, iffy, calleux, représenté en vert à gauche, peut être distingué d'eum en rouge. Dans le panneau central à l'extrême droite, on observe un résultat négatif. Trois points à retenir pour obtenir des résultats concluants : les températures de l'appareil doivent être maintenues aux valeurs prédéfinies.
Vous devez suivre très attentivement la procédure de coloration telle que décrite dans la notice du kit. Enfin, vous devez disposer d'un lecteur expérimenté qui effectue une lecture minutieuse de la lame. Ce protocole est utile pour prendre des décisions thérapeutiques dans le traitement de la septicémie provoquée par l'entérocoque.
Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.
Aperçu
Cet article présente un protocole rapide permettant d'identifier Enterococcus faecalis et d'autres espèces du genre Enterococcus à partir de cultures sanguines positives, au moyen d'un test d'hybridation in situ en fluorescence utilisant des acides nucléiques peptidiques (PNA FISH). Cette méthode permet une identification rapide et spécifique, facilitant ainsi le traitement de la sepsie.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Microbiologie
- Diagnostic clinique
- Maladies infectieuses
Contexte
- Les espèces d'Enterococcus sont des agents pathogènes importants dans les infections du sang.
- Une identification rapide à partir des hémocultures est cruciale pour un traitement efficace.
- La FISH avec sondes PNA offre une méthode spécifique pour identifier ces organismes.
- Le protocole est conçu pour être efficace et fiable.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode d'identification rapide des espèces d'Enterococcus.
- Améliorer la rapidité du diagnostic dans les environnements cliniques.
- Aider à prendre des décisions thérapeutiques rapides pour le traitement de la sepsie.
Méthodes utilisées
- Préparation de cultures sanguines et coloration de Gram pour confirmer la présence d'Enterococcus.
- Utilisation de sondes PNA spécifiques aux espèces d'Enterococcus.
- Microscopie à fluorescence pour la visualisation des échantillons hybridés.
- Inclusion de lames témoins pour l'évaluation de la qualité.
Résultats principaux
- Identification réussie des espèces d'Enterococcus par FISH avec sondes PNA.
- La microscopie en fluorescence distingue efficacement les espèces.
- Des résultats rapides facilitent une prise de décision clinique en temps opportun.
- Le protocole démontre une haute spécificité et fiabilité.
Conclusions
- Le protocole FISH avec PNA constitue un outil précieux pour le diagnostic microbiologique.
- Il accélère l'identification des agents pathogènes dans les hémocultures.
- Cette méthode peut avoir un impact significatif sur la prise en charge de la septicémie.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'identification rapide au niveau des espèces d'Enterococcus à partir de cultures sanguines soutient une utilisation appropriée des antimicrobiens et la surveillance des résistances dans la prise en charge du sepsis. La distinction entre E. faecalis et E. faecium oriente les décisions thérapeutiques précoces en raison de profils de résistance différents. Ce test PNA FISH, d'une durée de 1,5 heure, permet de réduire les risques liés aux choix thérapeutiques empiriques dans les programmes de recherche en maladies infectieuses.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmacie
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet de tester des hypothèses sur les mécanismes de virulence spécifiques aux espèces dans des modèles de bactériémie.
- Valeur opérationnelle : Fournit une identification microbienne standardisée pour des études précliniques de sepsie reproductibles.
- Valeur prédictive : Renforce la confiance dans la cible en associant l'identification des espèces à des profils de réponse différentielle aux médicaments.
Développement de criblages et de tests
- Prêt-à-l’emploi du test : Génère des signaux de fluorescence quantifiés pour la validation des hits dans les cascades de criblage antimicrobien.
- Reproductibilité : Inclut des contrôles positifs et négatifs intégrés assurant la robustesse du test entre différents opérateurs.
- Extensibilité : Compatible avec le traitement à haut débit de lames pour le profilage de bibliothèques de composés.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour la maladie : Modélise la physiopathologie de la bactériémie en permettant la caractérisation de modèles de sepsie stratifiés par espèce.
- Continuité translationnelle : Établit un lien entre la validation ciblée in vitro et les études d'efficacité in vivo en utilisant des souches microbiennes cliniquement pertinentes.
- Atténuation des risques : Réduit l'attribution erronée d'effets thérapeutiques à des cibles microbiennes incorrectes dans les modèles de sepsie.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Positionne l'identification microbienne comme un garde-fou essentiel entre la validation de la cible et l'optimisation du composé précurseur dans la découverte d'agents anti-infectieux.
- Découverte en biologie : Confirme l'activité sur la cible en vérifiant les espèces causales dans des modèles d'infection avant l'élucidation du mécanisme.
- Tri : Permet la détermination de la CMI spécifique à l'espèce pour une évaluation précise de la puissance des composés.
- Analytique : Fournit des résultats binaires par espèce permettant de classer les composés actifs selon leur spectre d'activité.
- Recherche translationnelle : Garantit que les modèles précliniques reflètent la diversité des isolats cliniques pour une validité prédictive.
- Réutilisation en entreprise : Adaptable à d'autres pathogènes à Gram positif par la refonte de la sonde, pour une application sur l'ensemble de la plateforme.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique dans l'interprétation des modèles de sepsie grâce à une identification précise des agents pathogènes.
- Valeur opérationnelle : Standardise les flux de travail microbiologiques entre les équipes de découverte et précliniques.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'avancement ou d'abandon en éliminant l'erreur d'identification des espèces comme facteur de confusion dans les données d'efficacité.
- Impact sur le portefeuille : Permet une progression différenciée selon le niveau de risque des candidats à spectre étroit par rapport à ceux à spectre large, fondée sur l'épidémiologie des résistances.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microscopie à fluorescence et en techniques d'hybridation des acides nucléiques.
- Dépend d'un équipement de cyclage thermique capable de maintenir une température de 55 °C pendant les étapes de fixation, d'hybridation et de lavage.
- Exige des protocoles standardisés de préparation des lames pour assurer une fixation homogène des échantillons et une accessibilité optimale des sondes.
- Requiert une validation sur diverses souches d'Enterococcus afin de confirmer la spécificité des sondes dans des panels d'isolats mondiaux.
- Limité aux espèces détectables pour lesquelles des sondes PNA sont disponibles ; les espèces nouvelles ou rares peuvent nécessiter des méthodes complémentaires.
