Comptage des cellules souches humaines
22 août 2007
La connaissance du nombre exact de cellules viables est nécessaire pour de nombreuses manipulations culture de tissus. Ce protocole décrit comment différencier entre les cellules vivantes et mortes et de quantifier les cellules en utilisant un hématimètre. Bien qu'il décrit compter humaine souches neurales / cellules précurseurs (hNSPCs), il peut être utilisé pour d'autres types cellulaires.
Maintenant, je vais vous montrer comment compter les cellules souches neuronales humaines. Vous devez compter vos cellules lorsque vous souhaitez les utiliser pour de l'immunochimie ou lorsque vous voulez effectuer une transfection avec un facteur nucléaire. J'utilise un hématomètre en contraste de phase doté d'une grille bordée, ainsi qu'un colorant appelé bleu de trypan. Ce colorant est utile car il permet de distinguer les cellules vivantes des cellules mortes.
Les cellules mortes ou en voie de mort absorbent ce colorant et apparaissent bleues. Lorsque vous observez les cellules au compteur hématologique, les cellules vivantes sont capables d'exclure ce colorant et, par conséquent, elles n'apparaissent pas bleues. De cette manière, vous pouvez déterminer la viabilité de vos cellules afin de préparer une solution de bleu de trypan et de milieu.
Je vais ajouter 20 microlitres de solution piège et bleue dans ce tube Eppendorf de 0,5 ml. Ensuite, je vais ajouter 25 microlitres de milieu. Ainsi, j'aurai actuellement 45 microlitres d'une solution composée de solution piège, de bleu et de milieu, de sorte que lorsque j'ajouterai 5 microlitres de suspension cellulaire, j'obtiendrai une dilution au dixième.
Et maintenant, je vais ajouter cinq microlitres de suspension cellulaire. Tout d'abord, je vais m'assurer que les cellules sont bien resuspendues en vortexant avec le doigt. Ensuite, je veux m'assurer que cette solution est bien homogénéisée.
Je vais donc monter et descendre le plateau plusieurs fois. Enfin, je vais charger environ 12 microlitres de cette suspension cellulaire dans un hémocytomètre. Il possède deux orifices et vous pouvez utiliser l'un ou l'autre.
Il suffit donc d'introduire la solution par cette ouverture, et le liquide sera aspiré par action capillaire. Maintenant, je suis prêt à effectuer le dénombrement. Voici une vue du cytomètre sanguin à 10 x ; ici, nous avons un quadrant qui contient 16 carrés.
Et comme vous pouvez le constater, nous pouvons observer ici des cellules vivantes et mortes. Ici, nous avons des cellules vivantes, comme celle-ci, celle-ci et celle-ci. Et nous avons également quelques cellules mortes, comme celle-ci.
Si vous observez attentivement, la cellule morte apparaît en bleu foncé, tandis que les cellules vivantes présentent une sorte de halo autour d'elles. Je vais donc maintenant compter toutes les cellules vivantes. Je vais procéder de gauche à droite et de haut en bas.
1, 2, 3, 4, 5, 6, 33, 1 32, 33, 34, 3 5, 3 6. Nous avons donc un total de trois six cellules dans ce quadrant. Ainsi, lorsque je vois des cellules situées en bordure du quadrant, comme le long de cette ligne ici, pour être cohérent, je compte les cellules qui se trouvent sur le bord gauche et sur le bord supérieur.
Et je compte systématiquement les cellules sur ces bords pour tous les quadrants du compteur hématique. Nous allons maintenant calculer le nombre de cellules par microlitre. Pour ce faire, je vais prendre la moyenne des cellules par quadrant, soit 38, et la multiplier par 10, ce qui correspond à un facteur déterminé par les dimensions de la chambre.
Et nous allons également multiplier par 10, qui est notre facteur de dilution dans ce cas. Et à la fin, nous obtiendrons le nombre de cellules par microlitre. Dans ce cas, nous avons donc 3 800 cellules par microlitre.
Et puisque nous avons resuspendu notre culot cellulaire dans 500 microlitres de solution, vous pouvez calculer le nombre total de cellules que vous avez. Et nous sommes prêts.
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Aperçu
Ce protocole décrit une méthode pour compter les cellules souches/precursrices neuronales humaines (hNSPCs) à l’aide d’un hémacytomètre. Il souligne l’importance de distinguer les cellules vivantes des cellules mortes dans diverses applications de culture tissulaire.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Culture de tissus
Contexte
- Le décompte des cellules viables est essentiel pour les manipulations de culture tissulaire.
- Les cellules vivantes peuvent exclure certains colorants, contrairement aux cellules mortes.
- Le compteur de cellules (hémacytomètre) est un outil standard pour le décompte cellulaire.
- Le colorant bleu de trypan est couramment utilisé pour évaluer la viabilité cellulaire.
Objectif de l'étude
- Fournir une méthode fiable pour compter les cellules souches neurales humaines (hNSPCs).
- Distinguer efficacement les cellules vivantes des cellules mortes.
- Aider les chercheurs à se préparer pour des expériences ultérieures telles que l'immunochimie ou la transfection.
Méthodes utilisées
- Utilisation d'un hémacytomètre en contraste de phase.
- Application du colorant bleu de Trippan pour distinguer la viabilité cellulaire.
- Comptage des cellules au microscope.
- Préparation d'une solution de bleu de Trippan et de milieu de culture.
Résultats principaux
- Différenciation réussie entre cellules vivantes et mortes.
- Quantification précise des CSPN humaines.
- Démonstration de l'efficacité du colorant bleu de Trippan.
- Validation de l'hémacytomètre comme méthode de comptage fiable.
Conclusions
- Le protocole offre une approche simple du comptage cellulaire.
- Il s'applique à divers types cellulaires autres que les hNSPC.
- La compréhension de la viabilité cellulaire est essentielle pour la réussite des expériences de culture tissulaire.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
La quantification précise de cellules souches/précurseurs neuronales humaines viables (hNSPCs) est essentielle pour des protocoles de culture tissulaire reproductibles dans le domaine de la découverte de médicaments en neurosciences. Ce protocole permet une évaluation fiable de la viabilité cellulaire et une mesure précise de la concentration, facilitant un semis expérimental reproductible pour des applications ultérieures telles que l'immunocytochimie et la transfection. En standardisant la discrimination entre cellules vivantes et mortes à l’aide du bleu de Trypan et du comptage sur hémacytomètre, cette méthode améliore la fiabilité prédictive des validations précoces de cibles et du développement d’essais.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet un ensemencement précis des hNSPC pour des études sur l'engagement ciblé et la modulation des voies.
- Valeur opérationnelle : Réduit la variabilité des tests cellulaires en assurant une quantité constante de cellules viables en entrée.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Fournit des données quantitatives et reproductibles sur la concentration cellulaire, essentielles pour la standardisation des tests.
- Valeur opérationnelle : Permet la préparation à grande échelle de suspensions cellulaires destinées à des formats de criblage à haut contenu.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Maintient une cohérence des entrées cellulaires au cours des étapes de transition de la découverte à la préclinique.
- Valeur opérationnelle : Facilite la collaboration pluridisciplinaire grâce à des pratiques standardisées de comptage cellulaire.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette méthode s'inscrit dans la phase précoce de la découverte, en soutenant une préparation cellulaire fiable depuis la validation de la cible jusqu'à l'optimisation des tests et les essais précliniques d'efficacité.
- Biologie de la découverte : Assure une administration précise des cellules pour les expériences de validation ciblée impliquant des hNSPC.
- Écrantage : Fournit des quantités cellulaires standardisées et quantifiables nécessaires à la reproductibilité des tests.
- Analytique : Produit des résultats sur la concentration de cellules viables et le nombre total de cellules, utilisés pour normaliser les conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Permet une continuité dans la manipulation des cellules entre les modèles de découverte in vitro et les modèles précliniques.
- Réutilisation en entreprise : Constitue une capacité transférable et peu complexe, applicable à plusieurs types cellulaires et projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Améliore la confiance prédictive en minimisant la variabilité des paramètres expérimentaux cellulaires.
- Valeur opérationnelle : Renforce la reproductibilité et la standardisation entre laboratoires et équipes.
- Valeur stratégique : Permet des décisions plus pertinentes d'aller/arrêt grâce à des bases d'essai fiables.
- Impact sur le portefeuille : Permet une progression ajustée au risque en assurant la qualité des données lors du criblage précoce de l'efficacité.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite des compétences de base en technique de culture tissulaire et en microscopie.
- Dépend de la disponibilité d'un hématimètre et d'un nettoyage adéquat afin d'éviter toute contamination.
- Exige une formation cohérente de l'opérateur pour assurer une sélection impartiale des cadrans et l'application rigoureuse des règles de comptage aux frontières.
- Limité par le débit du comptage manuel ; non adapté à l'automatisation à haut débit sans adaptation.
- Fonctionne selon une dilution et un mélange corrects afin de garantir un échantillonnage représentatif de la suspension cellulaire.
