Application de cartographie et de Enhancer-trap expression flippase dans larvaire et adulte Drosophile SNC

L'objectif général de l'expérience suivante est d'affiner l'expression de GAL4 à l'aide d'une lipase spécifique aux tissus et d'outils de conversion GAL80. Ceci est réalisé en générant une collection de lignées transgéniques de drosophiles porteuses d'un piège à enhanceurs Philippe et en déterminant le profil d'expression de la lipase dans le système nerveux central (SNC) pour chaque lignée. À l'aide d'une immunochimie avec un rapporteur GFP et des rapports GFP, il est possible de distinguer l'expression gliale de l'expression neuronale afin de croiser l'expression de GAL4 dans des lignées d'intérêt, à savoir les lignées ET flip, chez les drosophiles contenant un outil de conversion GAL80 dans la descendance.

L'analyse clonale peut être utilisée pour étudier l'affinement de l'expression de GAL quatre, par exemple dans l'œil. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que des lignées basées sur des promoteurs d'enhancer, associées à des outils de conversion GAL 80, peuvent être utilisées conjointement avec une large collection de lignées GAL quatre déjà disponibles au sein de la communauté des chercheurs sur la drosophile. De plus, ce concept peut être étendu à d'autres organismes modèles émergents utilisant le système GAL quatre UAS, comme le poisson-zèbre.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans la cartographie des circuits neuronaux sous-tendant le comportement. Bien que ce protocole démontre l'utilisation de la base flip dans un sous-ensemble de cellules photoréceptrices, la méthode intersectionnelle peut être appliquée à l'analyse d'autres tissus, y compris les tissus non neuronaux. À mesure que davantage de lignées de pièges activateurs d'enhanceurs de lipase seront caractérisées.

Le système Gal4 aux États-Unis est une technique importante largement utilisée par les biologistes travaillant sur la drosophile. Un inconvénient majeur de la plupart des lignées Gal4 est qu’elles s’expriment de manière trop étendue pour être utilisées dans la cartographie du comportement cérébral à l’aide des méthodes *fingering*. Il n’est pas possible d’ajuster finement l’expression de Gal4 dans les tissus d’intérêt avant d’utiliser un transgène ET-flip afin de restreindre partiellement l’expression des lignées Gal4.

Il est d'abord utile de connaître le profil d'expression du transgène ET flip x deux au stade tardif du développement des larves et chez les adultes afin de visualiser l'expression de flip a dans le SNC. Mettez en place un croisement entre des mâles portant le transgène d'intérêt ET t flip X deux et des femelles vierges possédant un rapporteur GFP pour l'expression de et flip. Récoltez les larves F1 de troisième stade errant pour la dissection. Placez-les dans une boîte de Petri propre et éliminez tous les débris à l'aide d'un pinceau, puis rincez la boîte une fois avec du PBS 1x.

Remplissez maintenant la boîte avec du PBS glacé une fois pour anesthésier les larves afin d'accéder au SNC. Saisissez le crochet buccal de la larve à l’aide d’une pince. Saisissez la cuticule près de la sphère antérieure étendue et retirez-la vers l’arrière. Le SNC reste attaché au crochet buccal, ainsi que quelques autres structures.

Maintenant, à l’aide de pinces, retirez toutes les structures excédentaires entourant le SNC pendant que vous disséquez le système nerveux central. Transférez-les individuellement dans une boîte de Pétri Pyrex de trois pouces remplie de PBS. Une fois que tous les SNC ont été disséqués, fixez-les en les immergeant complètement dans 200 microlitres de PFA à 4 % sur de la glace.

Si un SNC flotte, cela signifie qu'il n'a pas été entièrement débarrassé de tous les tissus environnants. Dans ce cas, utilisez une pince pour replonger le SNC dans le fixateur après 15 minutes de fixation, lavez le tissu 3 fois avec du PBS glacé, puis effectuez trois nouveaux lavages avec du PBT glacé. Le tissu est alors prêt à être observé en microscopie, marqué par des anticorps, ou stocké dans du PBT à quatre degrés Celsius pour une utilisation ultérieure.

Coloration à partir du même croisement utilisé pour collecter les larves afin de récolter les adultes F1 avant la dissection. Plonger cinq à dix mouches dans de l'éthanol à 95 % refroidi pendant 30 secondes pour éliminer la cire présente à la surface de la cuticule. Pour éliminer l'éthanol, laver les adultes trois fois avec du PBS à une fois refroidi sur glace, puis après le troisième lavage, transférer l'un d'eux dans une boîte de culture de 35 millimètres en silicagel remplie de PBS à une fois refroidi sur glace afin de préparer un adulte pour la dissection.

Placez-le avec le côté ventral vers le haut et insérez une épingle minion au milieu de l'abdomen. Commencez la dissection en utilisant une pince pour retirer les pattes. Ensuite, retirez la cuticule de la tête en fixant celle-ci au niveau des propodèmes et en décollant simultanément la cuticule depuis la partie inférieure de l'œil vers le sommet de la tête.

À l'aide de pinces aiguisées, retirez soigneusement et éliminez les tissus entourant le cerveau, car ces tissus présentent une forte autofluorescence et provoquent la flottaison du cerveau pendant la fixation. Le cerveau ne constitue qu'une partie du SNC adulte. L'autre partie est le cordon nerveux ventral ou VNC situé dans le thorax, qui doit également être disséqué.

Commencez par retirer la cuticule thoracique en fixant la mouche à la base de la patte postérieure et en tirant délicatement la cuticule thoracique jusqu'à la base du cou. Ensuite, pour exposer le cordon nerveux ventral, écartez doucement les deux moitiés de la cuticule thoracique. Enfin, détachez l'abdomen du thorax en fixant la mouche à la base de la deuxième patte et en tirant l'abdomen depuis la région proche du premier sternite abdominal.

Quatrièmement, nettoyez le CVM en le maintenant au niveau de la région humérale et en détachant délicatement les tissus entourant le CVM. Déchirez l'anneau de tissu conjonctif entourant la commissure cervicale et continuez à éliminer les tissus excédentaires tout en prélevant le cerveau. Transférez ensuite le cerveau et le CVM, en forme de poires, dans une boîte Pyrex de neuf puits contenant du PBS à 1 fois refroidi, maintenu sur de la glace.

Pour fixer les tissus adultes, les immerger dans du PFA à 4 % sur de la glace pendant 15 minutes. Procéder ensuite à trois lavages au PBS glacé et à trois lavages au PBT. Les tissus sont alors prêts à être observés ou marqués par des anticorps afin d'analyser avec précision l'expression du transgène.

Il est utile de marquer le SNC avec des marqueurs neuronaux ou gliaux afin de fournir un référentiel. Commencez par incuber le tissu à quatre degrés Celsius toute la nuit avec des anticorps dirigés contre les neurones ou les cellules gliales. Le jour suivant, lavez le prélèvement cinq fois avec du PBT et incubez-le avec l'anticorps secondaire fluorescent à température ambiante pendant deux heures. Enveloppez la plaque dans du papier d'aluminium pour éviter la photodégradation de l'anticorps une fois l'incubation terminée.

Lavez le prélèvement avec du PBS et montez-le intégralement sur une lame. Utilisez un anneau en plastique OSHA pour éviter que le tissu ne soit écrasé par la lame de couverture. Le système nerveux est désormais prêt à être examiné pour les profils d'expression de la GFP et de LL au microscope fluorescent.

Typiquement, trois à cinq réplicats sont analysés pour déterminer la reproductibilité du patron d'expression de flip. Le patron d'expression de flip dans la lignée flip peut être utilisé conjointement avec d'autres transgènes afin de modifier l'expression du répresseur GAL quatre GAL 80. La modification de l'expression du répresseur GAL 80 constitue une méthode efficace pour induire des changements.

Dans l'expression GAL quatre, une méthode consiste à éliminer l'expression de GAL 80 grâce à un transgène ; l'expression de GAL 80 inactivant GAL quatre, qui sinon induirait une dégénérescence oculaire dans tout l'œil. La lignée ET flip portant le numéro 6 88 A est utilisée ici afin d'évaluer l'efficacité de l'outil de conversion GAL 80 dans un sous-ensemble de photorécepteurs chez les descendants F1, en comparant le phénotype oculaire à celui des souches parentales. L'apparition d'une quelconque déformation oculaire ou dépigmentation confirme que le patron d'expression du flip est présent dans les photorécepteurs et que l'élimination de GAL 80 a été réussie.

Une stratégie complémentaire non redondante consiste à induire l'expression de GAL 80 à l'aide de la même ligne de recombinaison d'intérêt. Cette stratégie est très similaire à l'autre, mais maintenant la pigmentation et la dégénérescence sont supprimées chez la descendance F1. Dans flip X deux.

Expression des photorécepteurs Une fois la dissection du SNC maîtrisée, elle peut être réalisée en environ cinq minutes chez les adultes et en une minute chez les larves, si elle est effectuée correctement. Lors de cette procédure, il est important d'utiliser des pinces fines pour enlever la trachée et les tissus environnants, tant chez les adultes que chez les larves C et Ss. Il est essentiel d'utiliser une boîte de dissection exempte de fixateur. Le choc thermique par inversion est actuellement utilisé pour générer aléatoirement des clones.

En revanche, l'« enhancer trap flip » permet de générer des clones reproductibles, facilitant ainsi l'analyse morphologique et comportementale. Un autre avantage de la méthode du « finger » est qu'il est possible de restreindre davantage les patrons d'expression de GAL4 en utilisant des lignées supplémentaires basées sur l'« enhancer trap flip » et d'autres lignées gal. Un inconvénient de la configuration « tubulin stop GAL80 » est que certaines combinaisons de GAL4 et d'effecteurs UAS, telles que LAG4 et UAS-KIR, ne sont pas compatibles car elles entraînent la mort des mouches.

Ce problème peut être facilement surmonté en utilisant un effecteur conditionnel UAS, tel que UAS Shiri Ts, qui permet d'examiner un comportement à des températures restrictives, comme prévu. Toutes les lignées de lipase issues d'un piège à enhanceurs n'exprimeront pas des niveaux de lipase suffisamment élevés pour être utiles. Néanmoins, la technique du doigt décrite ici offre une nouvelle approche aux chercheurs travaillant sur Drosophila pour affiner l'analyse des mosaïques, que ce soit pour les circuits du développement ou pour le comportement.