Procédure pour l'ingénierie du poumon

L'objectif général de cette procédure est de générer un tissu pulmonaire en culture qui soit morphologiquement et physiologiquement comparable au tissu pulmonaire natif. Cela est réalisé en prélevant d'abord le cœur et les poumons d'un rat adulte. L'étape suivante consiste à canuler l'artère pulmonaire et la trachée, puis à connecter les poumons canulés à un bioréacteur pour la décellularisation.

Après la décellularisation et le rinçage, le poumon est transféré dans un bioréacteur de culture stérile et préparé pour l'ensemencement. La dernière étape de la procédure consiste à ensemencer le compartiment souhaité du poumon avec une population cellulaire préparée. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus, montrant que la matrice extracellulaire décellularisée est efficacement repeuplée de cellules exprimant des marqueurs pulmonaires spécifiques à chaque région, comme le révèle la microscopie par immunofluorescence.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes de culture in vitro des cellules pulmonaires est que les cellules conservent des phénotypes différenciés pendant une période prolongée, ce qui permet de les étudier pendant plusieurs semaines dans un substrat biologique tridimensionnel. Pour la décellularisation, les poumons sont reliés au bouchon du bioréacteur par l'intermédiaire de la canule vasculaire, et le bouchon est connecté à l'appareil de décellularisation. Le flacon en verre placé au-dessus des poumons est maintenu en position par un support à anneaux et une pince fixée.

À ce stade, les matériaux cellulaires peuvent être éliminés afin de produire une matrice extracellulaire servant de support, qui peut ensuite être réensemencée avec des matériaux cellulaires. L'assemblage du bioréacteur pour l'ensemencement et la culture de tissu pulmonaire génie-équipé est illustré dans ce schéma. Le raccord à verrouillage de la canule trachéale se connecte à une boucle respiratoire entre le réservoir trachéal et la chambre principale.

La boucle respiratoire comprend deux valves unidirectionnelles. Les positions sont disposées de sorte que le milieu suive un trajet différent à l’entrée et à la sortie du poumon. Un petit réservoir est temporairement intégré dans la ligne de perfusion pour l’ensemencement de cellules endothéliales.

Une pompe pulsatile est utilisée pour acheminer les cellules du réservoir vers le compartiment vasculaire du poumon. La perfusion vasculaire est assurée à l’aide d’une pompe péristaltique. Le milieu est perfusé dans l’artère pulmonaire par le biais de la canule attachée, circule à travers le réseau vasculaire pulmonaire et ressort par la veine pulmonaire directement dans le bioreacteur principal, où le milieu est aspiré pour la perfusion.

L'épithélium pulmonaire est positionné par injection dans la boucle respiratoire. La chambre principale contenant le poumon et le réservoir de trachée est utilisée pour la culture prolongée du poumon. Une fois les poumons extraits et les canules correctement insérées dans l'artère et la trachée, les poumons fraîchement prélevés doivent retenir l'air sans fuite.

Cela peut être vérifié en les gonflant avec de l'air tout en étant immergés dans un liquide. Aucune bulle ne doit apparaître, ce qui indiquerait une fuite d'air. Pour commencer le protocole, les poumons sont gonflés avec du PBS contenant du nitroprussiate de sodium jusqu'à ce qu'ils soient pleins, mais sans être surgonflés ; boucher immédiatement la canule trachéale afin que les poumons restent gonflés.

Ensuite, perfuser les poumons avec du PBS et du SNP pendant au moins 15 minutes à 15 millimètres de mercure. Après cela, retirer le bouchon de la canule trachéale pour permettre le dégonflement des poumons. Poursuivre la perfusion avec du PBS et du SNP de 15 à 30 minutes si nécessaire.

Rechargez le PBS et le SNP afin de maintenir une pression de perfusion comprise entre 10 et 15 millimètres de mercure. Pour commencer la procédure de décellularisation prolongée, le bouchon du bioréacteur est relié à l'appareil de décellularisation. Ensuite, les poumons sont connectés au bouchon.

À l’aide des raccords verrouillables reliés à la canule en forme de YS, la canule artérielle pulmonaire doit être connectée à la ligne de perfusion, tandis que la canule trachéale doit rester libre. Pour assurer une décellularisation complète du tissu, il est essentiel d’empêcher l’entrée d’air dans le système. Les valves unidirectionnelles intégrées dans les canules artérielle et trachéale permettent d’éliminer les bulles d’air dans les tubulures en autorisant un écoulement inversé dans celles-ci.

Par conséquent, permettez l'élimination des bulles d'air à l'aide de la seringue et assurez-vous que toutes les lignes soient débarrassées des bulles d'air. Commencez la perfusion avec la solution de décellularisation. Perfusion effectuée avec la solution de décellularisation.

Jusqu'à ce que 500 millilitres de solution aient perfusé à travers les poumons, la pression optimale est inférieure à 15 millimètres de mercure. Cela nécessitera typiquement 2,5 heures. Les débits sont généralement très lents au départ, puis augmentent rapidement durant la deuxième heure jusqu'à environ un millilitre par minute ou plus.

Pendant la perfusion, retirer périodiquement le liquide de décellularisation du bioréacteur tout en veillant à ce qu'il reste suffisamment de liquide pour maintenir le poumon et la canule trachéale. Une fois la perfusion avec le liquide de décellularisation terminée, transférer les poumons et le bioréacteur dans une hotte de culture tissulaire. Pour commencer le rinçage de l'organe, retirer le flacon de 500 millilitres contenant le liquide de décellularisation et le remplacer par un flacon stérile contenant jusqu'à un litre de PBS stérile.

Utilisez une aspiration sous vide ou une seringue pour vous assurer que les conduits sont débarrassés de tout air, puis perfusez du PBS à travers la vascularisation à une pression de 10 à 15 millimètres de mercure, de la même manière. Concernant la décellularisation, retirez périodiquement, en utilisant des techniques stériles, le PBS usé du bioréacteur et remplacez ou rechargez le flacon de PBS. Poursuivez le rinçage avec du PBS frais et stérile jusqu'à ce qu'au moins 2,5 litres de PBS stérile aient perfusé les poumons.

Cela prendra généralement deux jours à compter du début du processus de décellularisation, une fois le rinçage terminé. Transférez les poumons vers un nouveau système de bioréacteur stérile contenant du PBS frais additionné de 10 % de FBS et de 10 % de pénicilline-streptomycine, en veillant à ce que l'ensemble du circuit de perfusion ainsi que toutes les lignes des voies aériennes soient remplis de liquide. À partir de ce moment, une pompe pulsatile sera utilisée pour perfuser les poumons à raison de cinq millimètres par minute.

Stérilisez la matrice extracellulaire pulmonaire par perfusion nocturne avec du PBS contenant 10 % de FBS et 10 % de pénicilline-streptomycine. Une fois cette étape terminée, transférez les poumons dans une incubateur à 37 degrés Celsius pendant une heure ou jusqu'à ce que la température soit équilibrée. En prévision du traitement par la Ben Nase, l'étape suivante consiste à traiter les poumons avec la Ben Nase.

Pour éliminer l'ADN résiduel de chaque poumon, remplir d'abord une seringue de 10 millilitres uniquement avec du tampon Ben Nase préchauffé, et une autre seringue de 10 millilitres avec 90 unités par millilitre de Ben Nase dilué dans du tampon Ben Nase. Arrêter la perfusion des poumons.

Ensuite, insufflez la voie respiratoire avec du tampon Ben Nase tout en évitant d'injecter de l'air dans le poumon. Laissez le poumon se dégonfler pendant une minute. Ensuite, insufflez le poumon avec la solution Ben Nase.

Encore une fois, faites attention à ne pas introduire d'air dans le poumon après l'avoir gonflé avec Ben Nase. Laissez les poumons reposer sans perfusion ni ventilation à 37 degrés Celsius pendant une heure. À la fin de cette heure, reprenez la perfusion avec le PBS contenant 10 % de FBS et 10 % de pénicilline-streptomycine déjà présent dans le bioréacteur, puis poursuivez la perfusion toute la nuit jusqu'au jour suivant.

Après le rinçage et la stérilisation, la longue matrice extracellulaire peut être préparée pour la recolonisation cellulaire. Remplacez la solution de P-B-S-F-B-S benzo a par 250 millilitres de milieu de culture. Perfusez pendant au moins une heure avant d'introduire les cellules, puis remplacez par du milieu de culture frais juste avant la mise en place des cellules.

De nombreuses sources cellulaires peuvent être utilisées pour la recolonisation d'organes. Ici, on démontrera l'ensemencement à l'aide d'une population cellulaire épithéliale. Préparez d'abord une seringue contenant 15 millilitres d'une suspension cellulaire de la population de cellules épithéliales souhaitée.

Ensuite, remplir le réservoir aérien avec 80 millilitres de milieu de culture et s'assurer que toutes les lignes de ventilation sont débarrassées de l'air. Puis placer le bioréacteur dans une étuve à culture tissulaire à 37 degrés Celsius et connecter la pompe à seringue pour la ventilation. Ensemencer les cellules dans les poumons à l'aide d'un bolus rapide unique en injectant la suspension cellulaire de 15 millilitres dans la canule trachéale.

Veillez à ce que les filtres à air du bioréacteur principal soient bouchés. Ensuite, commencez immédiatement une seule inspiration lente à l’aide de la pompe à seringue pour prélever 60 millilitres d’air du bioréacteur principal à raison de trois millilitres par minute. Cette étape durera environ 20 minutes.

Laisser les poumons en statique pendant environ 18 heures après cela. Commencer la perfusion vasculaire lente à environ 0,5 millilitre par minute. Pendant la culture d'organe, la perfusion est généralement réalisée à raison d'un à trois millilitres par minute.

En utilisant une pompe à rouleaux pendant la culture épithéliale, la ventilation est généralement assurée à un débit continu d'une respiration par minute et d'un volume courant de cinq à 10 millilitres. À l'aide d'une pompe à seringue, l'air est cycliquement aspiré puis injecté dans le bioréacteur afin de simuler la respiration en alternant entre une pression négative et une pression atmosphérique à l'intérieur de la chambre principale. En raison de la nécessité de maintenir le bioréacteur étanche à l'air pendant la ventilation, celle-ci doit être interrompue quotidiennement et l'air présent dans la chambre principale doit être renouvelé.

En outre, le milieu doit être changé environ tous les trois à quatre jours. Pendant la culture, environ la moitié du volume total doit être renouvelée à chaque fois lors de la culture de l'épithélium pulmonaire et de l'endothélium vasculaire. Dans l'échafaudage monté sur le bioréacteur, nous sommes en mesure de générer un tissu pulmonaire capable de participer aux échanges gazeux pendant de courtes périodes.

Une coloration standard hémat, toin et éoin de poumon de rat natif est présentée ici afin d'être comparée à une coloration H et E de poumon de rat décellularisé. La matrice extracellulaire finalement décellularisée devrait être totalement dépourvue de matériaux cellulaires et conserver les caractéristiques macroscopiques, microscopiques et ultrastructurales du poumon natif. La coloration H et E permettra la visualisation de tout ADN résiduel adhérant au support en raison d'une décellularisation ou d'un rinçage insuffisants, ce qui compromettrait les conditions optimales pour l'ensemencement cellulaire et la culture ultérieure du poumon.

Et le bioréacteur devrait produire une distribution homogène des cellules au sein des cinq lobes du poumon et assurer une couverture d'environ 70 % du support de matrice extracellulaire. Ces images comparent le poumon natif au poumon repeuplé après coloration par immunofluorescence. Pour les principaux marqueurs pulmonaires, la population cellulaire cultivée est positive pour la protéine sécrétoire des cellules de Clara, la protéine pro-sécrétoire C et l'aquaporine 5.

Les marqueurs d'intérêt sont indiqués en rouge et les noyaux colorés au DAPI apparaissent en bleu dans tous les panneaux. Une fois maîtrisée, cette procédure, de la décellularisation à la régénération, peut être réalisée en quatre à cinq jours si elle est effectuée correctement.