Caractériser Volatiles bactérienne secondaire à l'aide d'ionisation électrospray spectrométrie de masse (SESI-MS)

L'ionisation secondaire par électrospray, la spectrométrie de masse ou CS EMS permet l'analyse des composés volatils bactériens sans nécessiter de traitement préalable de l'échantillon. L'espace de tête de la culture bactérienne est déplacé par du dioxyde de carbone dans la chambre à réaction CS EI. Lorsque les composés volatils traversent la chambre à réaction SSI, ils passent à travers le nuage d'électrospray et s'ionisent.

Une fois ionisés, les composés volatils sont dirigés vers le spectromètre de masse pour analyse. L'excès de gaz vecteur et les composés volatils bactériens non réactifs passent à travers un filtre de 0,22 micron destiné à éliminer tout agent bactérien, mesure supplémentaire de protection avant rejet dans une hotte chimique. En définitive, ce protocole de spectrométrie de masse par ionisation chimique en continu permet d'obtenir en quelques minutes des profils caractéristiques des composés volatils bactériens.

Nous prévoyons que cette technologie pourrait être utilisée dans de nombreuses applications, notamment l'analyse de l'air expiré, le dépistage de maladies infectieuses par le souffle, ou même appliquée à des systèmes alimentaires où nous serions en mesure de détecter rapidement des agents pathogènes présents sur nos aliments ou dans ceux-ci. Cette technique présente plusieurs avantages majeurs par rapport aux méthodes existantes telles que la CPG-SIFT, la spectrométrie de masse et la RMN. Premièrement, les composés volatils ne nécessitent aucun prétraitement avant l'analyse.

Deuxièmement, il est possible de fragmenter des ions spécifiques dans le mélange volatil, ce qui facilite l'identification des composés. Troisièmement, cette méthode est rapide. Elle prend généralement moins de cinq minutes.

Pour analyser chaque échantillon, choisissez le récipient approprié pour la culture, en tenant compte des besoins de croissance de l'espèce ainsi que de la délivrance efficace des composés volatils au spectromètre de masse. Dans cette démonstration, nous avons sélectionné des flacons standard de 100 millilitres pour milieux de culture. Les composés volatils bactériens sont acheminés vers le spectromètre de masse par un flux de gaz vecteur afin d'assembler le dispositif de transport.

Les conduites de gaz doivent correspondre aux bouteilles de culture équipées de bouchons filetés possédant au moins deux orifices d'entrée. Insérez les conduites d'entrée et de sortie du gaz à travers les orifices d'entrée, et obturez tous les orifices supplémentaires avant de mettre en culture vos échantillons. Sous pression, plongez les récipients dans l'eau afin de vérifier les fuites.

Les fuites de gaz constituent une cause principale de résultats atypiques sous forme de signaux ioniques faibles ou absents. Les signaux ioniques volatils s'intensifient pendant la nuit. Cultures d'E. coli, K 12, et de Pseudomonas aeruginosa, PAO1, en LB Lennox, préparation de deux réplicats biologiques pour chaque espèce.

Préparez neuf flacons stériles de culture contenant chacun 50 millilitres de LB Lennox et un flacon non inoculé à utiliser comme témoin. Inoculez chaque culture de nuit dans deux flacons d'échantillons, créant ainsi des réplicats techniques. Incubez les cultures et le témoin pendant 24 heures à 37 degrés Celsius. Étant donné que le CEMS est spécifiquement conçu pour échantillonner les composés volatils, limitez l'utilisation de produits de soin parfumés avant d'utiliser l'instrument de manière rigoureuse.

Fermez hermétiquement tous les produits chimiques volatils en laboratoire et contrôlez au maximum les courants d'air pendant les tests afin d'éviter toute contamination de votre instrument et des lignes de transfert de gaz. En présence d'agents biologiques viables, installez des filtres de taille de pore appropriée dans la ligne de gaz vecteur. Ces filtres n'interféreront pas avec le transfert des composés volatils vers la chambre de réaction sesi, mais pourraient légèrement réduire l'efficacité du transfert des aérosols.

Afin de vérifier que l'alimentation électrique est éteinte et que le système est déchargé d'électricité, contrôlez que les voyants lumineux sur l'alimentation sont éteints. Assurez-vous que la tension indiquée sur le multimètre est nulle et mettez à la terre les câbles électriques. À ce stade, installez la solution d'électrospray pour analyse.

En mode ion positif, utilisez une solution d'électrospray composée de 0,1 % d'acide formique, de 5 % de méthanol et de 94,9 % d'eau. Afin d'obtenir une intensité et une stabilité de signal optimales, allumez le gaz porteur de dioxyde de carbone et réglez le débit à deux litres par minute. Appliquez une pression sur le réservoir d'électrospray pour amorcer l'acheminement de la solution d'électrospray vers la chambre à réaction à un débit de cinq nanolitres par seconde. Ensuite, allumez l'alimentation électrique et réglez la tension à 2,5 kilovolts.

La tension appliquée influence l'intensité du signal des ions et la stabilité du cône électrospray pour notre système, avec des tensions comprises entre deux et cinq kilovolts. Ces valeurs donnent les meilleurs résultats en mode ions positifs. Faites preuve de prudence, car à ce stade, les surfaces métalliques de la source d'ionisation sont susceptibles de provoquer un choc dangereux. Configurez maintenant une méthode d'ajustement pour surveiller le spectre de SEMS.

Désactivez la case à cocher d'acquisition multicanaux ou MCA. Réglez le temps d'acquisition sur 10 à 15 minutes et démarrez l'acquisition des données. Observez les spectres du gaz porteur et effectuez des ajustements fins de la tension appliquée afin d'obtenir un chromatogramme ionique total stable et des balayages reproductibles.

Continuez à acquérir des spectres et un A TIC pendant cinq minutes pour vous assurer que l'instrument est stabilisé avec l'instrument assuré. Saisissez les paramètres d'acquisition appropriés pour votre expérience. Enregistrez un spectre de fond du gaz vecteur pour les expériences futures.

Pour collecter un spectre témoin. Diriger le flux de gaz vecteur à travers les lignes de dérivation, puis fixer l'échantillon témoin, avec les vannes fermées, aux lignes de transfert de l'instrument. Ouvrir les vannes menant au flacon d'échantillon et fermer les vannes des lignes de dérivation.

Pour des spectres reproductibles. Laisser le système s'équilibrer pendant 30 secondes, période durant laquelle l'humidité dans la chambre à réaction se stabilise. Pour s'assurer que le système est équilibré, surveiller le courant ionique total (TIC), qui varie pendant la période d'équilibration avant de se stabiliser.

Une fois le système équilibré, lancez la collecte du spectre. Après la collecte du spectre, retirez le flacon d'échantillon en ouvrant d'abord les lignes de dérivation du gaz vecteur, puis en fermant les vannes d'échantillonnage.

Et enfin, retirez le flacon d'échantillon. Rincez le système avec le gaz vecteur pendant deux à quatre minutes afin d'éliminer l'humidité et les composés volatils adsorbés des lignes de transfert et d'éviter la persistance d'échantillons entre les analyses. Collectez les données de profil volatil pour chaque échantillon bactérien en enregistrant périodiquement des spectres témoins supplémentaires afin de garantir une soustraction complète des blancs.

Les profils volatils en mode ionisation positive pour E. coli et P. aeruginosa, cultivés en aérobiose dans du LB Lennox pendant 24 heures à 37 degrés Celsius, sont distincts. Le spectre volatil d’E. coli est dominé par un pic à un rapport masse/charge de 118, tandis que le spectre de Pseudomonas aeruginosa contient une plus grande variété de pics attribuables aux protéines.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important que vous enregistriez les paramètres instrumentaux que vous avez optimisés pour votre analyse, tels que la tension appliquée, la composition de la solution d’électrospray et le débit du gaz porteur. Il est également essentiel de conserver des enregistrements de vos spectres représentatifs afin de pouvoir reproduire vos analyses à l’avenir. N’oubliez pas que le travail avec des bactéries pathogènes et une haute tension peut être extrêmement dangereux.

Par conséquent, des précautions telles que la limitation de l'accès au CMS à spectrométrie de mobilité ionique durant l'expérience doivent toujours être prises. Vous devriez désormais être en mesure d'obtenir de façon reproductible un spectre CSS et EMS des composés volatils bactériens dans votre système. Bonne chance.