Les micropuces Silicon pour la manipulation d'interaction cellule-cellule

Bonjour, je suis Elliot Hu. Je suis chercheur postdoctoral dans le laboratoire de Tia au Massachusetts Institute of Technology. Aujourd'hui, nous allons préparer des cultures cellulaires sur des puces micro-mécaniques en silicium. Les dispositifs ressemblent à de petits peignes qui s'emboîtent et nous permettent de manipuler précisément les interactions entre deux populations cellulaires différentes.

Aujourd'hui, nous allons étudier l'interaction entre les hépatocytes hépatiques et les cellules stromales de soutien. Plus précisément, des cellules de fibroblastes 3T3 sont cultivées sur la surface supérieure des peignes, de sorte qu'en déplaçant les doigts du peigne, vous pouvez déplacer les cellules et modifier leur arrangement spatial. Chaque dispositif est divisé en deux parties qui s'emboîtent selon deux configurations possibles.

La première met les deux populations cellulaires en contact l'une avec l'autre. La seconde écarte légèrement les deux populations de manière à ce que les cellules ne puissent pas se toucher. Ici, les interactions par contact sont empêchées, mais les interactions par l'intermédiaire de facteurs sécrétés sont conservées.

Commençons par parler de la manière de manipuler les pièces avec des pinces. J'aime utiliser à la fois des pinces en téflon plus grandes et des pinces métalliques plus petites à extrémité ronde. Avec les pinces plus grandes, vous pouvez saisir les pièces par les bords, comme ceci ; pour les pièces plus grandes dotées de bras, vous devez faire attention de ne pas casser les bras car ils sont très fragiles.

Vous souhaitez donc les prendre à l'arrière de la pièce, comme ceci. À l'aide de pinces en métal, vous pouvez accéder à l'intérieur du trou et saisir directement les puces. Les pièces plus grandes s'insèrent dans une paroi d'une plaque à 12 puits, tandis que les pièces plus petites s'adaptent soit dans une plaque à 24 puits, soit peuvent être associées aux pièces plus grandes.

Dans une plaque de 12 puits, j'utilise généralement la pince métallique. Lorsque je manipule les pièces dans les puits pour assembler deux éléments, je place habituellement la pièce la plus grande dans le puits en premier et je la pousse complètement d'un côté. Ensuite, je prends la pièce complémentaire et je la place de l'autre côté du puits, puis je les assemble en utilisant deux pinces, une dans chaque puits.

Je peux maintenant verrouiller les pièces ensemble, soit en configuration d'espacement, soit en configuration de contact. Si je souhaite séparer les pièces, j'aime d'abord tirer les pièces en configuration d'espacement, puis tirer verticalement vers le haut pour retirer la pièce. Les dispositifs sont fabriqués en silicium, ils doivent donc être revêtus afin de permettre une adhérence cellulaire adéquate.

Vous allez probablement recevoir les dispositifs déjà revêtus de polystyrène et traités au plasma, nous partirons donc de ce point de départ. Tout d'abord, nous allons utiliser du collagène pour recouvrir la surface à laquelle les hépatocytes s'attacheront. Nous placerons les peignes d'hépatocytes dans une solution de collagène à 50 microgrammes par millilitre et incuberons à 37 °C pendant 45 minutes.

Les peignes de fibroblastes, en revanche, n'ont pas besoin d'être revêtus. Après l'incubation, nous aspirons la solution de collagène et effectuons un lavage à l'eau. Nous allons maintenant fixer les ES ensemble en contact avec des parties complémentaires afin de former une surface plane pour la semence cellulaire.

Tout d'abord, nous allons remplir certaines puits avec de l'éthanol à 70 %. Je vais insérer une paire dans chaque puits, puis les verrouiller ensemble. Après les avoir verrouillés, nous devons examiner les pièces au microscope afin de nous assurer qu'elles sont coplanaires.

Parfois, les pièces peuvent se verrouiller de manière désalignée. Au microscope, vous observerez qu'elles se trouvent sur deux plans focaux différents. Dans ce cas, séparez simplement les pièces et remettez-les ensemble après avoir vérifié que l'alignement est correct. Ensuite, laissez les pièces tremper un moment dans l'éthanol pour les stériliser.

Souvent, je suis pressé, donc je fais simplement tremper pendant 10 minutes. Après la stérilisation, nous devons rincer soigneusement. Aspirez entièrement l'éthanol et rincez à l'eau, puis aspirez et rincez à l'eau une nouvelle fois, et enfin aspirez l'eau et remplacez par votre milieu de culture.

Plaçons maintenant les cellules sur les dispositifs. Généralement, nous suspendons les cellules à une concentration de 500 000 cellules par millilitre, et nous pipetons un millilitre de cette suspension au-dessus de chaque paire de peignes en utilisant une plaque de 12 puits. Ainsi, nous avons ensemencé les fibroblastes à raison de 500 000 cellules par millilitre dans deux des puits.

De même, nous avons prélevé une suspension de 500 000 hépatocytes par puits et les avons ensemencés dans les deux autres puits. Avant l'incubation, nous allons agiter soigneusement les cellules afin de garantir une répartition homogène. J'aime agiter trois fois verticalement, trois fois horizontalement, puis répéter cette séquence trois fois.

Après agitation, nous allons placer l'échantillon dans l'incubateur et laisser les cellules au repos pendant 15 minutes, puis nous allons les agiter à nouveau. Après une agitation toutes les 15 minutes pendant une heure, nous allons ensuite aspirer la suspension cellulaire et la transférer dans une nouvelle suspension de cellules. Nous allons répéter cette procédure jusqu'à l'obtention d'une couche confluente de cellules.

Généralement, avec les fibroblastes, il faut une ou deux mises en culture. Avec les hépatocytes, cela peut nécessiter de deux à quatre mises en culture. Pour obtenir une monocouche confluente, les cellules sont mises en culture à une densité assez élevée ; l'agitation assure une répartition uniforme des cellules.

Après le premier ensemencement, une couche de cellules clairsemée se forme. Remarquez que les cellules s'attachent uniquement aux doigts qui ont été recouverts de polystyrène et de collagène. Après l'ensemencement de cellules fraîches et une incubation d'une heure supplémentaire, toujours avec agitation toutes les 15 minutes, la couche cellulaire devient plus dense.

Après le troisième ensemencement, nous obtenons une bonne densité cellulaire, et nous pouvons désormais arrêter une fois que les cellules ont été ensemencées sur les peignes. Nous souhaitons manipuler les cellules afin de les disposer selon la configuration expérimentale souhaitée. Les dispositifs sont maintenant séparés de leurs parties complémentaires et incubés pendant 24 heures.

Après 24 heures, les cellules se sont étendues pour former une monocouche confluente à la surface des peignes. Nous souhaitons maintenant établir une co-culture. Le peigne d'hépatocytes et le peigne de fibroblastes sont désormais transférés dans le même puits et verrouillés ensemble selon la configuration initiale souhaitée.

Si désiré. Après une certaine durée, vous pouvez modifier la configuration. Par exemple, on peut passer à la configuration avec espace après 18 heures : les pièces sont placées dans le même puits, poussées ensemble jusqu'à atteindre la configuration avec espace, puis repoussées en contact avant d'être à nouveau ramenées en configuration avec espace.

Et maintenant, nous allons retirer une lame. Ce que nous allons faire maintenant, c'est suivre le processus consistant à enlever l'ancien revêtement de polystyrène, nettoyer les lames, puis appliquer un nouveau revêtement de polystyrène et les préparer pour la culture cellulaire. En retirant l'ancien revêtement de polystyrène et en appliquant un nouveau, nous nous assurons qu'aucun élément lié à l'expérience précédente n'interférera avec la nouvelle expérience.

Une fois votre expérience terminée, la première chose à faire est de traiter vos cellules au javel et ensuite rincer vos peignes et l'eau. Avant de placer les puces dans le toing, assurez-vous qu'elles soient parfaitement sèches. Ici, nous avons quelques peignes que j'ai simplement laissés sécher à l'air pendant un certain temps, et je vérifie qu'ils soient complètement secs.

Nous allons donc prélever un peu de toing et le placer dans ce haut-parleur en verre. Nous allons utiliser une pipette en verre ici afin de ne pas le dissoudre. Le Halloween dissout le plastique, nous ne pouvons donc pas utiliser une pipette en polystyrène classique.

Très bien, cela suffit. Maintenant, nous allons prendre quelques-unes de ces pièces, les placer dans le récipient, et je vais allumer l'agitateurbain pour les agiter, puis nous couvrirons le tout avec du papier d'aluminium afin d'empêcher le toluène de s'évaporer. Après deux heures, le toluène aura dissous la majeure partie du polystyrène sur les peignes, et nous pourrons simplement les retirer et les faire sécher à l'air libre.

Après le rinçage Halloween, les pièces devraient être relativement débarrassées de polystyrène et relativement propres. Toutefois, nous devons que les pièces soient extrêmement propres afin que la nouvelle couche de polystyrène adhère correctement, car en cas de propreté insuffisante, celle-ci a tendance à se détacher au milieu de l'expérience lorsque les cellules commencent à tirer dessus.

Ce que nous allons faire maintenant est un nettoyage à l'acide piranha. J'ai placé les pièces dans un récipient en verre et nous allons chauffer ce mélange. Nous allons donc les mettre sur un chauffe-plaque.

Et voici de l'acide sulfurique et du peroxyde d'hydrogène. Je vais verser l'acide sulfurique en premier, et ici, assurez-vous que toutes les pastilles soient immergées sous le liquide. Parfois, elles ont tendance à flotter.

Et maintenant que nous travaillons avec des produits chimiques assez corrosifs, assurez-vous de porter les équipements de protection appropriés. Ici, je porte des gants en nitrile. Nous allons maintenant verser le peroxyde d'hydrogène dans l'acide ; faites attention, car il s'agit d'une réaction exothermique.

Vous pouvez donc voir qu'il y a un léger dégagement de fumée lors de la réaction, mais nous souhaitons ajouter de l'énergie au système afin de le rendre encore plus réactif. Nous allons donc maintenant chauffer à environ 120 degrés Celsius, nous sommes actuellement à 120. Vous pouvez dès lors être assuré que tous les résidus de votre culture cellulaire seront entièrement éliminés de vos puces. À ce stade, vous devez simplement laisser la réaction suivre son cours complet jusqu'à ce que tout le peroxyde d'hydrogène soit consommé.

À ce stade, le mélange cessera de mousser. La réaction dure donc environ une demi-heure. Une fois que vous ne voyez plus de bulles, vous pouvez simplement éteindre le plaque chauffante et laisser refroidir.

Et nous allons les transférer dans de l’eau distillée bouillie. Encore une fois, assurez-vous d’utiliser des pinces en téflon, pas en métal, et vous pouvez simplement les saisir pour les transférer. Maintenant, nous allons simplement les rincer sous un filet d’eau DDH₂O. Je la prends généralement directement à la bouteille Meine et nous laisserons couler l’eau pendant au moins 10 minutes ici.

Et ce faisant, nous allons rincer à l’eau courante pendant 10 minutes afin d’éliminer toutes les traces d’acide après le hachage. L’acide doit être entièrement éliminé des lamelles, que nous allons simplement conserver sous l’eau jusqu’au moment où nous serons prêts à recouvrir le polystyrène, un polystyrène de poids moléculaire 45 000 que nous avons obtenu de Sigma. Nous allons alors peser une petite quantité ici.

Nous disposons de 400 milligrammes que nous allons dissoudre dans du toluène à une concentration de 100 milligrammes par millilitre. Le toluène doit donc être manipulé sous hotte. Par ailleurs, comme nous allons utiliser du toluène pour dissoudre du polystyrène, nous devons nous assurer de ne pas porter d'équipement de laboratoire constitué de polystyrène.

Ici, nous utilisons du polypropylène, un récipient conique et une pipette en verre. Puisque j'ai 400 milligrammes de polystyrène, je vais ajouter quatre millilitres de toing. Nous allons maintenant homogénéiser par vortex pendant une demi-heure jusqu'à ce que le polystyrène se dissolve. Nous allons maintenant simplement agiter le tube par vortex à la vitesse la plus basse pendant environ 20 minutes à une demi-heure.

Je vais donc fixer le tube au vortex. Je n'ai pas besoin de le maintenir en place pendant toute la durée. Après 20 à 30 minutes, le polystyrène devrait être dissous et nous serons prêts à procéder au revêtement.

Nous allons maintenant appliquer par rotation le polystyrène dans notre installation. Notre appareil d'application par rotation se trouve dans un local propre. Ici, nous devons porter un bonnet, des lunettes, une blouse, des surchaussures et des gants, mais cela pourrait ne pas être identique dans votre installation.

Avant d'utiliser ce mandrin, je souhaite le protéger du polystyrène. Nous allons donc le recouvrir de papier d'aluminium, en veillant à ce qu'il soit le plus plat possible sur la surface afin que la puce puisse s'y poser parfaitement. Nous allons percer un petit trou exactement au centre pour pouvoir maintenir un vide sur la puce.

Le programmeur de rotation est réglé à 2 400 tr/min et 30 secondes. Nous pouvons maintenant prendre l'une de nos puces, la positionner de manière à ce que le centre de la puce recouvre le trou, et je vais d'abord couper le vide lorsque je place le polystyrène, puis activer le vide et enfin démarrer la rotation. Pour les parties plus petites, nous pouvons déposer un peu moins de 10 gouttes.

Et pour les pièces plus grandes, il faut un peu plus de 10 gouttes de polystyrène. Nous allons les faire tourner pendant 30 secondes à 2 400 tr/min. Maintenant, nous allons prendre les puces recouvertes de polystyrène et les placer dans le four à 120 degrés C, ce qui est supérieur au point de transition vitreuse du polystyrène.

Il va donc redonner un nouvel aspect à la surface pour la lisser légèrement, et il va également densifier et durcir le plastique. Je le laisse généralement au four toute la nuit. Le processus prend probablement au moins plusieurs heures pour s'achever.

Après une cuisson de toute une nuit, les puces sont prêtes pour le traitement au plasma. Nous allons maintenant exposer le polystyrène à un plasma d'oxygène, ce qui modifiera l'énergie de surface afin que les protéines et les cellules adhèrent mieux. Nous allons donc simplement charger les puces dans la chambre à plasma et faire le vide.

Un bon réglage à utiliser consiste en 200 mil, un cycle de vide et 200 watts de puissance pendant une minute sous un flux de gaz d'oxygène. Maintenant que le système est mis sous vide, nous allons introduire l'oxygène. Très bien, nous pouvons maintenant activer la puissance RF et amorcer le plasma pendant une minute.

Lorsque le plasma fonctionne, il émet effectivement une lueur, comme une ampoule fluorescente. Après une minute d'exposition au plasma, nous allons rétablir la pression à la pression atmosphérique et nous pourrons sortir les pièces.

Les pièces sont désormais prêtes pour le revêtement en protéines et l'alimentation cellulaire. L'objectif de la conception de ce dispositif était de nous permettre de manipuler de manière dynamique la microarchitecture des tissus. En effet, l'organisation microscopique des tissus dans l'organisme, notamment la position relative des cellules les unes par rapport aux autres, est très importante pour déterminer la fonction de chaque cellule en culture en laboratoire.

Jusqu'à récemment, nous n'avons pas été capables de reproduire cela correctement, mais au cours des cinq à dix dernières années, les chercheurs ont commencé à pouvoir microstructurer des cellules sur un substrat de culture tissulaire, plaçant ainsi les cellules exactement là où nous souhaitons qu'elles se trouvent dans une plaque de culture. Ce faisant, ils ont pu découvrir certains aspects importants de la biologie fondamentale des interactions entre cellules à l'échelle microscopique. Or, ce que nous n'avons pas encore réussi à faire jusqu'à présent, c'est réaliser cela de manière dynamique.

Il s'agit de modifier l'organisation d'une culture cellulaire en cours d'expérience. Cela est important car, dans l'organisme, le tissu n'est pas un environnement statique. Nous avons des cellules qui se déplacent et se réorganisent, notamment lors de la cicatrisation ou du développement.

Mais même dans un organe normal en homéostasie, il se produit beaucoup de mouvements. L'aspect technique le plus difficile à maîtriser consiste simplement à manipuler physiquement les pièces. Au début, lorsque vous commencez à travailler avec ce système, vous pourriez être intimidé par la fragilité des composants ou par la finesse des mouvements que vous devez effectuer.

Mais je pense que si vous vous entraînez un peu avec cet outil, vous ne devriez pas avoir trop de difficultés. Certains des contextes où nous observons un rôle pour ce dispositif, par exemple dans le développement embryonnaire, sont ceux où les cellules entrent en contact avec une série de différents environnements cellulaires lorsqu'elles migrent à travers diverses couches embryonnaires. On sait que les interactions avec chacune de ces couches, au fur et à mesure du contact successif, orientent de plus en plus les cellules vers une voie spécifique de différenciation.

Nous pensons donc que ce type de dispositif pourrait être approprié pour tenter de reproduire ce type d'événement en laboratoire. L'un des aspects de l'organisation microscopique que nous souhaitions particulièrement examiner était la différence entre les cellules communiquant par interactions de contact, où les membranes cellulaires peuvent se toucher directement, et les facteurs solubles sécrétés dans le milieu environnant et diffusant vers une cellule située un peu plus loin. Or, souvent, lorsque des cellules sont en co-culture et exercent un effet l'une sur l'autre, il n'est pas clair si ce sont des interactions de contact ou des facteurs sécrétés qui jouent un rôle déterminant.