Imagerie cellulaire en direct d'extrusion de l'épiderme du poisson zèbre développement

Le maintien des tissus épithéliaux nécessite l'élimination continue des cellules endommagées et mourantes sans perturber la fonction barrière. Pour y parvenir, l'épithélium expulse les cellules en voie de mort en formant et en contractant un anneau d'actine et de myosine dans la cellule entourant la cellule mourante, afin de l'éjecter tout en refermant les éventuels espaces laissés par son départ. Dans cet article vidéo, une méthode permettant d'induire et d'observer en temps réel l'expulsion de cellules apoptotiques à partir de l'épiderme de larves de poisson zèbre est présentée.

Comme illustré, ceci est réalisé par injection d'une sonde d'actine F marquée par une protéine fluorescente rouge dans des embryons de poisson zèbre transgéniques au stade d'une seule cellule, exprimant la protéine fluorescente verte dans l'épiderme, afin de visualiser les filaments d'actine dans les tissus épithéliaux. À quatre jours après la personnalisation, les larves exprimant à la fois la GFP et la RFP sont ensuite traitées avec du G418 pour induire l'apoptose dans l'épiderme. Les dynamiques de l'actine et les changements de forme des cellules épithéliales survenant pendant l'extrusion sont visualisés par imagerie en laps de temps sur un microscope confocal à disque tournant.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les analyses par force immunologique est que nous pouvons observer les changements rapides et la dynamique de l'actine qui se produisent pendant le processus d'extrusion dans un tissu épithélial vivant. Dans cette vidéo, nous allons vous montrer une procédure d'imagerie de l'extrusion de cellules apoptotiques depuis l'épiderme de poissons-zèbres en développement, en temps réel. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire afin de comprendre comment les cellules réorganisent de manière coordonnée leur cytosquelette d'actine pour éliminer les cellules apoptotiques tout en maintenant la fonction barrière, et comment la perturbation du processus d'extrusion peut conduire à certains états pathologiques.

Commençons donc. Pour visualiser la dynamique de l'actine pendant l'extrusion cellulaire dans l'épiderme de zebrafish en développement, commencez par décongeler l'ARN transcrit précédemment sur de la glace. Nous transcrivons l'ARNm Mr. codant pour une protéine fluorescente rouge fusionnée au domaine d'homologie de la calpine de l'utrophine et de la protéine liant l'actine. Ajoutez du phénol rouge à l'ARN selon un rapport un pour un, afin d'obtenir une concentration finale d'ARN d'environ 30 nanogrammes par microlitre, puis chargez un microlitre de cette solution dans une aiguille capillaire étirée par remplissage arrière.

Prélevez environ 75 embryons de stade à une cellule C-K-G-F-P dans du tampon E trois. A l’aide d’une pipette à pâtes de taille cinq et trois quarts, transférez les embryons prélevés dans le moule de microinjection et orientez délicatement les embryons dans la rigole à l’aide de la pince FST Dumont numéro cinq. Travaillez rapidement pour éviter d’avoir à injecter l’ARN dans des embryons à stades multiples sous un microscope stéréoscopique de laboratoire standard.

Utilisez un microinjecteur contrôlé par pression pour injecter l'ARN dans le vitellus des embryons sous forme de phénol fossilisé. Un colorant rouge doit être visible dans l'embryon après l'injection. Veillez à injecter au moins 50 embryons pour chaque expérience.

Trier les embryons pour éliminer les œufs non fécondés ou endommagés et incuber tous les embryons restants à 28 degrés Celsius. Après 24 heures, utiliser un microscope stéréofluorescent pour sélectionner les embryons de poisson zèbre présentant un niveau élevé de fluorescence GFP dans l'épiderme ainsi qu'une fluorescence de l'actine marquée par RFP. Incuber les embryons sélectionnés à 28 degrés Celsius jusqu'au moment de commencer le traitement médicamenteux destiné à induire l'apoptose par exposition aux aminosides.

L'antibiotique G quatre 18 ou un médicament provoque l'extrusion des cellules apoptotiques de l'épiderme des larves de poisson zèbre en développement. Importamment, ce traitement ne fonctionne que sur des larves âgées de quatre jours après la fécondation ou plus pour induire l'extrusion cellulaire. Réunir jusqu'à 25 larves de poisson zèbre de quatre jours après la fécondation exprimant à la fois la GFP et la RFP dans une boîte de culture de 35 par 10 millimètres contenant trois millilitres de milieu E trois.

Remplacer soigneusement le milieu par trois millilitres d’E trois contenant un milligramme par millilitre de G quatre 18 et incuber les larves dans le médicament pendant quatre heures à l’obscurité à 28 degrés Celsius. Ensuite, retirer le milieu et le remplacer par du milieu E trois préchauffé contenant 0,02 % de trica, puis procéder au montage des larves pour l’imagerie. Transférer jusqu’à trois larves dans un tube fendor de 1,5 millilitre et éliminer la majeure partie du milieu E trois.

À l’aide d’une pipette munie d’une pipette coupée, prélevez 120 microlitres de gélose à faible fusion à 1 % et mélangez dans le tube. Ensuite, pipetez délicatement le mélange de larves et de gélose sur le verre de couverture situé au fond d’une boîte de culture Matech. À l’aide d’un support de broche FST muni d’une broche interchangeable ou d’une aiguille en tungstène, orientez rapidement les larves de manière qu’elles soient droites et bien à plat contre le verre de couverture.

Laisser le aose durcir. Ensuite, remplir délicatement la boîte avec du milieu E trois contenant 0,02 % de trica. Nous avons constaté que l'ensemble du processus d'extrusion des cellules apoptotiques à partir de l'épiderme des larves de poisson zèbre en développement prend environ 20 minutes.

Ici, nous démontrons comment configurer une expérience d'imagerie en laps de temps à l'aide d'un microscope confocal à disque tournant et du logiciel and or IQ afin d'acquérir une série temporelle de plans Z à travers une seule couche de l'épiderme du poisson zèbre. Commencez par allumer les lasers argon et hélium-néon, la caméra du microscope et la lampe fluorescente epi dans le logiciel and or IQ. Créez un protocole de série temporelle contenant les longueurs d'onde à imager.

La fréquence des intervalles entre les prises d'images et le nombre de répétitions de la capture. Placez délicatement la boîte de Pétri contenant l'échantillon sur la platine du microscope, puis utilisez un objectif 20 fois avec lumière transmise pour focaliser sur les larves. Mettez en place l'objectif à immersion dans l'eau 40 fois à la position correcte. Avec cet objectif, nous pouvons filmer environ 20 à 25 cellules par champ, ce qui nous permet de suivre les comportements cellulaires pendant l'extrusion, tout en résolvant les dynamiques d'actine au niveau subcellulaire.

Placez soigneusement une goutte d'eau sur l'objectif de 40 fois et posez rapidement la boîte de Mattec par-dessus. Identifiez l'échantillon à l'aide de l'éclairage en champ clair, puis utilisez la fluorescence épiscopique à 488 nanomètres pour vous focaliser spécifiquement sur l'épiderme positif pour la GFP. Passez en mode de balayage confocal.

Ajustez l'intensité du laser et le temps d'exposition pour chacun des canaux en conséquence. Veillez à équilibrer la puissance du laser et la durée d'exposition pour une détection optimale de votre signal et pour éviter toute phototoxicité. Pour identifier les cellules en extrusion, utilisez la fluorescence en épifluorescence afin de visualiser l'épiderme marqué par la GFP et repérez un groupe de cellules présentant un motif en rosace classique, constitué d'un ensemble de cellules entourant une petite cellule ronde au centre.

En outre, on devrait observer une accumulation de l'actine marquée par le RFP, visible sous forme d'un anneau entourant la petite cellule ronde située au centre, caractéristique typique de l'extrusion cellulaire. Une fois qu'une cellule en cours d'extrusion a été identifiée, définissez rapidement les limites supérieure et inférieure pour la série Z ainsi que la taille du pas. Commencez ensuite à acquérir quatre jeux de données confocales en 4D afin d'examiner les données et de visualiser la contraction de l'anneau d'actine ainsi que les comportements épithéliaux survenant autour de la cellule mourante.

Au fil du temps, réalisez des projections 3D des séries en Z et enregistrez les données sous forme de fichier vidéo. Cette étape peut être effectuée à l'aide de divers logiciels. Cette figure montre l'expression de RFP UTR CH dans l'épiderme de larves de poisson-zèbre CK GFP quatre jours après la fécondation.

Ici, des projections en images fixes de Z issues d'un film en accéléré montrent la dynamique de l'actine en temps réel. Au cours du processus d'extrusion des cellules épithéliales, les flèches indiquent l'anneau d'actine formé par les cellules voisines, qui se contracte et se referme en deux minutes. Après cette procédure, nous pouvons combiner d'autres méthodes avec cette technique, comme l'utilisation d'inhibiteurs chimiques ou de mutations génétiques, afin de mieux comprendre comment la modification de l'extrusion peut conduire à certains états pathologiques.

Étant donné l'incapacité à éliminer les cellules apoptotiques, nous venons de vous montrer comment mettre en place une expérience d'imagerie en temps réel afin de visualiser le processus d'extrusion à partir de l'épiderme du poisson-zèbre en développement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de limiter la quantité de lumière à laquelle votre échantillon est exposé afin d'éviter tout phénomène de photoblanchiment ou de toxicité. Voilà donc tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.