Caractérisation des isolés, ventilés et instrumentés poumons de souris perfusées avec un flux pulsatile

Pour étudier les relations pression-débit pulsatiles dans les poumons. Ce protocole explique comment isoler, ventiler et perfuser les poumons de souris. La trachée est exposée chirurgicalement afin d'assurer la ventilation.

Ensuite, le cœur et les poumons sont isolés afin que l'artère pulmonaire et l'oreillette gauche puissent être canulées. Le système pulmonaire est alors perfusé. Les expériences sont réalisées en modifiant le débit, l'ampleur, la forme d'onde et/ou la fréquence du flux dans l'artère pulmonaire.

Les formes d'onde de pression de l'artère pulmonaire et de l'oreillette gauche obtenues sont enregistrées et démontrent les relations pulsatoires entre pression et débit. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les préparations in vivo, est qu'elle permet d'observer des modifications des relations pression-débit. Ces relations pression-débit pulsatoires peuvent être obtenues en l'absence de variations du statut volémique, du tonus du système nerveux sympathique, de l'activité et des effets de l'anesthésie.

De plus, la plupart des préparations pulmonaires isolées mesurent uniquement les relations pression-débit en régime permanent, alors que notre technique permet de déterminer les relations pression-débit pulsatile. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la physiologie pulmonaire, telles que : comment la maladie vasculaire pulmonaire affecte-t-elle l'hémodynamique pulmonaire pulsatile, ou comment le raidissement des grosses artères pulmonaires influence-t-il la postcharge du ventricule droit ? La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car l'exposition du cœur et des poumons ainsi que la fixation de la canule dans l'artère pulmonaire sont difficiles à apprendre.

Une pression excessive provenant de l'instrumentation peut provoquer un œdème pulmonaire, et un placement inadéquat de la canule peut perforer l'artère pulmonaire. Avant de commencer l'expérience, il est nécessaire de préparer le système IL one utilisé pour ventiler et perfuser le poumon isolé. Les tubulures doivent être raccordées aux capteurs de pression.

O puisez et purgez complètement le système avec de l’eau distillée réchauffée à 37 degrés Celsius, et éliminez toutes les bulles présentes dans les tubulures. Ensuite, amorcer les tubulures de la pompe Endur tech avec du PBS à 1 %. Maintenant, effectuez le réglage à zéro.

La pression de chaque transducteur P 75 est réglée en fermant d'abord sa vanne vers le système IL et en ouvrant sa vanne vers l'atmosphère. Ensuite, utilisez l'amplificateur SIS pour remettre automatiquement la pression à zéro avant de préparer l'animal. Humidifiez le dispositif IO en imbibant la pièce poreuse en céramique d'eau distillée. Après avoir anesthésié la souris, stabilisez-la pour la chirurgie en épinglant ses pattes avant sur une plaque de liège.

Maintenant, vaporisez la poitrine avec de l’alcool à 95 %. Utilisez une pince droite pour saisir la peau au niveau du cou et faites une ouverture d’un centimètre à l’aide des ciseaux droits. Une fois l’intérieur du cou exposé, retirez le tissu glandulaire blanc présent dans les muscles superficiels tout en recherchant l’œsophage et la trachée.

Isolez l'œsophage et la trachée des tissus situés sur les côtés et en arrière, puis placez une suture lâche autour de la trachée. Pour canuler la trachée, effectuez soigneusement une petite incision en forme de V sur un côté à l’aide des petites ciseaux. Prenez ensuite la souris et placez-la dans le système IL un en utilisant une pince effilée.

Saisir la canule trachéale et l'insérer dans la trachée. Fixer la canule à l'aide d'un point de suture. Commencer la ventilation avec de l'air ambiant, pulvériser de l'alcool sur le thorax, puis retirer la peau à l'aide de pinces droites et de ciseaux droits.

Couper la peau vers le haut le long du sternum. Relever la peau de chaque côté et couper selon la ligne des côtes inférieures. Saisir ensuite le processus xiphoïde avec une pince et utiliser des ciseaux à bout rond pour percer un trou dans le diaphragme au niveau où il rejoint la partie inférieure du sternum.

Saisissez le diaphragme et découpez-le en le détachant des côtes. À l’aide de ciseaux à extrémité sphérique, saisissez à nouveau le processus xiphoïde et utilisez les ciseaux à extrémité sphérique pour couper soigneusement le sternum en remontant à travers les côtes, sans endommager les poumons, le cœur ni les vaisseaux sanguins. Pour exposer le cœur, saisissez les côtes gauches et sectionnez-en les extrémités.

Injectez maintenant lentement 0,1 millilitre d'héparine dans le ventricule droit. Après l'injection, retirez le reste des côtes. Utilisez l'extrémité arrière ou ronde de la pince pour repousser doucement les poumons loin de la côte tout en coupant les côtes sous un microscope. Retirez le tissu glandulaire présent dans la graisse située au-dessus du cœur.

Utilisez la pince pour écarter les tissus et les retirer. À l’aide des ciseaux à ressort, placez une suture autour de l’aorte et de l’artère pulmonaire, puis retirez délicatement le cœur avec une pince émoussée. Il devrait y avoir peu de résistance.

Effectuez maintenant une suture lâche avec une double boucle. Ensuite, retirez l'abdomen inférieur. Utilisez des ciseaux angulés pour couper à travers les côtes et la colonne vertébrale.

Cela provoquera un écoulement sanguin important. Utilisez un coton-tige pour arrêter l'écoulement. Une fois l'écoulement sanguin arrêté, amorcer le système IL avec quatre millilitres de RPMI à l'aide d'une seringue remplie de 10 millilitres de RPMI.

Il est conseillé de vérifier deux fois que le tube ne contient aucune bulle. Cannulez maintenant le ventricule droit en pratiquant une petite encoche près de l'apex et en insérant la canule en direction du bas pour atteindre l'artère pulmonaire. La pointe de la sonde doit être visible à travers la paroi presque transparente de l'artère pulmonaire.

Ensuite, resserrez le point de suture autour de la canule, de l'aorte et de l'artère pulmonaire pour canuler le ventricule gauche. Faites une petite encoche au niveau de l'apex et insérez la canule en visant vers le haut, en direction de l'oreillette gauche. Une légère pression peut être nécessaire pour localiser la valve, mais une fois celle-ci trouvée, la canule glisse à travers et reste en place sans nécessiter de suture.

Infuser manuellement le RPMI à partir de la seringue de 10 millilitres à un débit de 0,3 millilitre par minute jusqu'à l'observation d'un écoulement dans le tube de sortie. S'il n'y a pas d'écoulement dans le tube de sortie, repositionner la canule du ventricule gauche. Toutefois, s'il n'y a pas d'écoulement dans les poumons, interrompre l'expérience car il y a probablement une fuite au niveau de l'artère pulmonaire.

À présent que le cœur est entièrement canulé, reliez la seringue de 60 millilitres au système IL un. À l’aide de la pompe à débit constant, perfusez le RPMI Perfuse huit à un débit de un millilitre par minute. Vérifiez la présence de fuites pendant la perfusion initiale.

Perfuser progressivement les poumons pendant encore deux minutes, durant lesquelles les poumons deviendront blancs. Pour les études de flux pulsatile. Régler d'abord le déplacement du piston de la pompe unique aux niveaux souhaités.

Ensuite, réglez le débit constant. Ouvrez maintenant la vanne de la pompe osli et commencez l'enregistrement des données juste avant d'exécuter le profil d'écoulement osli. Une fois terminé, ouvrez le fichier de sortie des données et tracez le débit expérimental en fonction des écoulements expérimentaux obtenus lors de l'essai initial.

Régler le déplacement du piston de la pompe oscillatoire à chaque fréquence de manière à obtenir le débit maximal souhaité. Maintenir la ventilation à pression constante. Pendant l'acquisition des données pour les essais d'écoulement stable, fermer la vanne menant à la pompe unique et régler le débit stable au niveau souhaité. Commencer l'enregistrement des données et exécuter progressivement le protocole d'écoulement stable.

Collecter des données pendant au moins 10 secondes à chaque débit entre les essais. Réinitialiser le débit à 0,5 millilitre par minute. Veiller à maintenir la ventilation à une pression constante pendant la collecte des données.

Si des essais à pression auriculaire gauche nulle sont souhaités, retirez le tube de sortie pendant la réalisation des essais. Surveillez attentivement la présence de RPMI dans le tube des voies respiratoires. Le RPMI ne doit en aucun cas atteindre les transducteurs de pression des voies respiratoires, sans quoi ils seraient endommagés.

Voici les résultats de la perfusion en écoulement stationnaire avec un débit Q dans la rangée supérieure et les pressions artérielles pulmonaires et auriculaires gauches résultantes dans la deuxième rangée, sous diverses conditions. Dans les deux premiers panneaux, la pression auriculaire gauche a augmenté puis diminué avec Q parce que le tube de sortie était en place : le premier panneau montre la pression d'air en fin d'inspiration, la pression inspiratoire, et le second montre la pression d'air en fin d'expiration, la pression expiratoire. Ensuite, le tube a été retiré afin que la pression auriculaire gauche reste constante et indépendante de Q. Puis la hauteur du tube de sortie a été ajustée manuellement de sorte que la pression auriculaire gauche soit plus élevée.

Mais indépendamment de Q à nouveau, le premier panneau montre la pression aérienne en fin d'inspiration, la pression inspiratoire, et le second montre la pression aérienne en fin d'expiration. La pression expiratoire. Les relations résultantes entre pression et débit dans l'artère pulmonaire pour chaque cas peuvent être obtenues en traçant la pression en fonction du débit.

Voici les résultats de la perfusion en flux pulsatile avec le débit Q dans le panneau supérieur et les pressions résultantes dans l'artère pulmonaire, l'oreillette gauche et les voies aériennes. Dans le panneau inférieur. À partir de ces relations pression-débit pulmonaires pulsatile, on peut calculer l'impédance vasculaire pulmonaire, qui reflète la postcharge totale du ventricule droit.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 20 à 30 minutes. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de prendre son temps et de se détendre afin que les mains restent stables. Une fois que les poumons sont correctement perfusés, la partie la plus difficile est terminée.

Après cette procédure, d'autres techniques peuvent être réalisées, comme l'histologie ou des dosages biochimiques sur le tissu pulmonaire, afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que les mécanismes moléculaires responsables des modifications observées dans les relations pression-débit pulsatile au niveau pulmonaire. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs en physiologie pulmonaire pour explorer le rôle de gènes et de protéines spécifiques dans le développement et la progression des maladies vasculaires pulmonaires, à l'aide de souris génétiquement modifiées.