Solide plaque à base de restriction alimentaire Caenorhabditis elegans

La procédure consiste à appliquer une restriction alimentaire sur la plaque standard à base d'agar en milieu marin afin d'étudier ses effets sur la longévité, la reproduction et le métabolisme. Ceci est réalisé en mesurant d'abord avec précision la concentration des bactéries qui seront utilisées comme source alimentaire. La deuxième étape de la procédure consiste à diluer correctement la culture bactérienne à des concentrations appropriées.

Ensuite, préparez des plaques SDR avec des bactéries inactivées. Enfin, mettez en place des expériences SDR avec une population de vers synchronisés par âge. Les résultats des mesures de production de progéniture et de durée de vie peuvent montrer une production de progéniture retardée et réduite, ainsi qu'une durée de vie moyenne accrue.

L'avantage principal de cette technique par rapport à 60 méthodes comme Dian en milieu AZA est que l'ensemble de l'expérience sera réalisée sur un milieu solide standard à base d'AGA, utilisé par la plupart des laboratoires de recherche sur les organismes à sang chaud. Pour les expériences de restriction alimentaire et chez *C. elegans*, établissez des courbes d'étalonnage distinctes pour chaque souche bactérienne utilisée comme source alimentaire. Prélevez une colonie unique de la bactérie *E. coli* OP50 à partir d'un isolement récent sur gélose LB et inoculez trois millilitres de bouillon LB liquide en culture agitée à 37 °C pendant la nuit. Préparez des dilutions sériées par doublement du facteur deux de la culture de nuit.

Ensuite, mesurez l'absorbance de chaque dilution à 600 nanomètres au spectrophotomètre, en triple exemplaire. Ensuite, diluez davantage chaque suspension bactérienne d'un facteur d'un million, puis ensemencez uniformément 0,4 millilitre de la suspension bactérienne de chaque dilution sur une boîte de Petri au milieu LB de 100 millimètres et incubez à 37 degrés Celsius pendant 18 à 24 heures. Comptez le nombre de colonies bactériennes développées sur chaque boîte afin de calculer le nombre d'unités formant colonies par millilitre pour chaque échantillon.

Tracez maintenant l'OD 600 en fonction de la concentration bactérienne et effectuez une analyse de régression linéaire afin d'établir la relation entre les valeurs d'OD 600 mesurées et les concentrations bactériennes OP 50. Pour cette méthode, une concentration bactérienne de 1 × 10¹¹ UFC/mL est utilisée dans la condition d'alimentation ad libitum, et de 1 × 10⁸ UFC/mL comme condition optimale d'alimentation en régime restreint. Toutefois, quatre à six concentrations bactériennes différentes peuvent être nécessaires pour établir une relation complète dépendante de la dose.

Pour le SDR et ses réponses. Préparer un inoculum avec une colonie unique de bactéries Escherichia coli OP50 dans trois millilitres de bouillon LB liquide, cultivé dans un agitateur à 37 degrés Celsius pendant six à huit heures. Transférer la culture OP50 dans un nouveau flacon contenant 500 millilitres de bouillon LB et faire croître toute la nuit afin que les bactéries atteignent la saturation, si nécessaire.

Préparez une dilution appropriée de la culture OP 50 pour la mesure de l'absorbance à OD 600. Pour déterminer la concentration bactérienne, faites précipiter les bactéries par centrifugation à 1500 Gs pendant 20 minutes. Éliminez le surnageant et resuspendez les bactéries à une concentration de un fois 10 à la 12e UFC par millilitre.

Préparez maintenant 10 millilitres de cultures bactériennes à six concentrations différentes, allant de 1 × 10¹² à 1 × 10⁷ UFC par millilitre. Déposez 0,2 millilitre de culture bactérienne au centre d'une plaque N GM solidifiée de 60 millimètres. Évitez de toucher la surface de la plaque avec l'embout de la pipette, car les rayures sur la surface permettent aux vers de s'enfouir dans les zones aérées.

Placer les boîtes dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, appliquer 10 microlitres de 100 milligrammes par millilitre de carbonic soin et 10 microlitres de 50 milligrammes par millilitre de can mycin sur chaque boîte afin d'obtenir une croissance bactérienne résiduelle. Conserver les boîtes contenant différentes concentrations d'antibiotique ayant tué les bactéries à quatre degrés Celsius pour une utilisation ultérieure jusqu'à un mois.

Il est important de préparer et de conserver suffisamment de plaques, de préférence issues du même lot pour l'ensemble de l'expérience. Réalisez un test au moins un à deux jours à l'avance afin de vérifier la viabilité des bactéries. Grattez quelques bactéries à partir des plaques SDR et étalez-les sur une plaque N GM vide contenant du carbonyle, de la sein et de l'antimycine.

Placer la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant six à huit heures et confirmer l'absence de croissance bactérienne. Pour la plupart des études liées au SDR, telles que l'analyse de la durée de vie et le profilage de la production de progéniture, la préparation d'une population de vers âgés synchronisés est essentielle. Utiliser un prélèveur de vers en platine pour transférer 20 à 30 adultes reproductivement actifs sur plusieurs plaques NGM classiques.

Avec OP 50. Selon le nombre d'œufs requis pour les expériences, un plus grand nombre d'adultes peut être nécessaire. Laisser les boîtes à 20 degrés Celsius pendant quatre heures afin de permettre la ponte.

Retirer les adultes de la boîte et examiner visuellement les boîtes à la recherche d'œufs. Continuer à incuber les boîtes à 20 degrés Celsius pour permettre aux descendants de se développer jusqu'au stade adulte tardif L4/jour 1. Généralement, cela prend trois jours pour les vers de type sauvage N2 à 20 degrés Celsius.

Pour l'analyse de la durée de vie. Transférez 10 à 12 vers adultes du jour 1 sur une plaque SDR afin d'initier la restriction alimentaire. Pour obtenir une puissance statistique suffisante, utilisez un total de 60 à 100 vers pour chaque condition SDR.

Évaluez la viabilité de chaque ver tous les deux à trois jours jusqu'à ce que tous les vers soient morts. Transférez les vers sur des plaques SDR fraîches tous les deux jours pour éviter la famine. Cette courbe d'étalonnage représente la concentration d'OP 50 en fonction de l'OD 600.

L'équation générée par l'analyse de régression linéaire peut être utilisée pour tous les calculs futurs des concentrations bactériennes OP 50. Cette étude évalue l'effet de traitements chroniques de SDR sur la durée de vie moyenne de différentes souches de vers, comparée à la réponse dépendante de la dose normale des vers de type sauvage au SDR. L'effet du SDR sur la durée de vie est partiellement supprimé par la surexpression de DR deux, tandis que la mutation DAF 16 MU 86 n'a aucun effet sur l'allongement de la durée de vie induit par le SDR.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment effectuer Dian sur le jeu standard AGA basé sur l'élégance en mer.