Propension oligomérisation domaine transmembranaire déterminée par dosage ToxR

L'objectif général de l'expérience suivante est d'étudier les propensions à la ligamentisation des protéines, des domaines transmembranaires ou des T MDs dans un environnement membranaire naturel. Ceci est réalisé en exprimant le domaine transmembranaire d'intérêt dans e coli sous forme d'une protéine chimérique associée à la protéine de liaison au maltose pour une localisation dans le périplasme et à tox. R en tant que rapporteur transcriptionnel ; la ligamentisation induite par le domaine transmembranaire entraîne le dimérisation de tox R et l'activation de la transcription de LXi. Dans une deuxième étape, les cellules sont lysées puis traitées avec du ONPG, qui est hydrolysé par la bêta-galactosidase en espèce absorbant la lumière, le O-nitrophénolate ou ONP.

Les niveaux suivants de ONP sont quantifiés en mesurant l'absorbance de la lumière à 405 nanomètres. Afin de déterminer les niveaux de domaine transmembranaire, les résultats de ligamentisation révèlent la propension à la ligamentisation des domaines transmembranaires selon un test rapporteur tox R. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes biophysiques existantes telles que l'électrophorèse sur gel SDS ou la fluorescence réside dans le fait que le comportement du domaine transmembranaire est étudié dans une bicouche phospholipidique naturelle par expression chez E. coli, plutôt que dans un système mimétique de membrane tel qu'un détergent.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des protéines membranaires, telles que l'élucidation des caractéristiques structurales essentielles impliquées dans l'association des hélices transmembranaires. Avant le début de ce protocole, sept plasmides exprimant la protéine chimérique requise sont préparés à partir d'oligonucléotides synthétisés commercialement, représentant le TDS d'intérêt encadré par NHE un et BMH un. Sites de restriction après la préparation des plasmides, décongeler délicatement les cellules compétentes fhk 12 sur de la glace. Une fois décongelées, transférer les cellules dans des tubes de culture de 15 millilitres, ajouter 200 nanogrammes de chaque ADN plasmidique dans un tube séparé, puis incuber les cellules sur de la glace pendant 30 minutes.

Ensuite, soumettez les cellules à un choc thermique de 90 secondes à 42 degrés Celsius, suivi d'une incubation sur de la glace pendant deux minutes dans 800 microlitres de milieu SOC, puis incubez les échantillons à 37 degrés Celsius sous agitation pendant une heure. Après l'incubation, inoculez cinq millilitres de milieu LB contenant du chloramphénicol et de l'aose avec 50 microlitres du mélange de transformation, en utilisant des tubes de culture de 15 millilitres en triplicata pour chaque échantillon. Enfin, incubez les échantillons à 37 degrés Celsius sous agitation pendant 20 heures. Pour mesurer la totalité de la ligamentisation, l'activité de la bêta-galactosidase TDS est déterminée.

Commencez par préchauffer le lecteur de plaque à 28 degrés Celsius. Utilisez le stock tampon Z pour préparer des solutions tampon Z fraîches, comme décrit dans le protocole écrit. Transférez le chloroforme du tampon Z du tube vers le réservoir, en veillant à pipeter uniquement la couche aqueuse supérieure du mélange chloroforme-tampon Z.

Placer la plaque de 96 puits sur une feuille de papier munie d'une grille afin d'assurer un transfert précis par pipette ; ajouter 100 microlitres de tampon Z contenant du chloroforme dans chaque puits d'une plaque de 96 puits, suivis de cinq microlitres de chaque culture en quadruplet. Omettre la culture dans les quatre puits qui serviront de témoins. Mesurer la DO à 595 nm de la plaque pour déterminer la densité cellulaire.

Ajouter 50 microlitres de tampon Z contenant du SDS dans tous les puits de la plaque. Agiter ensuite la plaque dans le lecteur de plaques pendant 10 minutes pour lyser les cellules, après ajout de 50 microlitres de ZPA pour ONPG dans tous les puits. Replacer la plaque dans le lecteur de plaques et mesurer l'OD à 405 nm toutes les 30 secondes pendant 20 minutes.

Déterminez le niveau d'activité de la bêta-lactosidase au moyen d'un calcul d'unités de Miller normalisées par rapport au témoin. Un immunotransfert (Western blotting) est effectué afin de vérifier une expression protéique équivalente entre les constructions. Commencez par mélanger 50 microlitres des cultures réalisées en triple, puis centrifugez les échantillons à l'aide d'une microcentrifugeuse.

Éliminer le surnageant par pipetage et resuspendre. Suspendre le culot résiduel dans deux volumes de tampon de charge d'échantillon, charger 7,5 microlitres de chaque échantillon sur un gel standard à 8 % et réaliser l'électrophorèse à 125 volts pendant une heure et cinq minutes après le transfert. Incuber la membrane avec un anticorps anti-M-V-P-H-R-P conjugué afin de visualiser la protéine chimérique, observée à environ 70 kilodaltons, certains produits de dégradation étant parfois visibles aux alentours de 48 kilodaltons.

On observe également la MVP endogène à 45 kilodaltons. Afin d'évaluer l'insertion correcte dans la membrane du construit chimérique de TMD, la lignée cellulaire PD 28 déficiente en protéine de liaison au maltose est utilisée ; lorsque ces cellules sont cultivées dans un milieu minimal contenant le maltose comme seule source de carbone, seules les cellules exprimant un produit d'expression intégré à la membrane, avec la protéine de liaison au maltose correctement localisée dans le périplasme, peuvent croître. Transformez les cellules PD 28 comme décrit pour les cellules fhk 12 et ensemencez deux millilitres de milieu LB.

Faire croître les cellules à 37 degrés Celsius avec agitation à 300 tr/min pendant la nuit après l'incubation. Récupérer les cellules par centrifugation et les laver par resuspension dans deux millilitres de PBS et pipetage doux à l’aide d’une pipette à embout large. Après la récupération des cellules par centrifugation, les laver à nouveau avec du PBS une deuxième fois, puis effectuer une centrifugation finale et une resuspension dans un millilitre de PBS.

Utilisez 25 microlitres des cellules resuspendues pour ensemencer cinq millilitres de milieu minimal. Incubez les cellules à 37 degrés Celsius avec agitation pendant 15 heures. Transférez 200 microlitres de chaque échantillon dans une plaque à 96 puits et effectuez la lecture de l'OD à 595 nm à l'aide du lecteur de plaques.

Répétez ce processus toutes les deux heures jusqu’à 25 heures. La propension à la ligamentisation de chaque domaine transmembranaire de la protéine intégrale de membrane multi-passant, la protéine latente de membrane un, a été analysée à l’aide du test rapporteur transcriptionnel tox R. Le domaine transmembranaire cinq présente une forte propension à la ligamentisation, comme en témoignent les unités de Miller élevées, ce qui est comparable au témoin positif GPA, une séquence dimérisante bien établie.

Une mutation délétère dans le domaine transmembranaire cinq D un 50 A réduit la capacité de la séquence à tout ligaturer LMP un, TM un ne ligature pas de manière significative et présente un signal très faible en unités Miller, légèrement supérieur au signal du témoin négatif, constitué de cellules FHK 12 non transformées. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment déterminer si un hélice transmembranaire d’intérêt possède la capacité de former des complexes d’ordre supérieur dans un environnement membranaire naturel. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de pipeter avec une extrême précaution dans la plaque 96 puits afin d’éviter de grandes erreurs et de s’assurer qu’aucune bulle d’air n’est introduite.