Tridimensionnelle optique résolution microscopie photoacoustique

L'objectif général de cette procédure est de démontrer la microscopie photoacoustique à résolution optique, ou OR-PAM, de la microcirculation, une technique non invasive et sans marquage. Cela est réalisé en anesthésiant tout d'abord l'animal expérimental. La deuxième étape de la procédure consiste à positionner la région d'intérêt en déplaçant la tête d'imagerie du microscope photoacoustique à résolution optique, puis les paramètres de balayage sont définis et l'acquisition d'images est initiée.

En définitive, les distributions de la concentration totale en oxygène et de la saturation en oxygène de l'hémoglobine sont obtenues par le calcul des données expérimentales à multiples longueurs d'onde. La microscopie photoacoustique à résolution optique repose sur une excitation par laser et une détection ultrasonore. Un faisceau laser court est focalisé dans un tissu biologique.

L'absorption de la lumière génère un chauffage transitoire et une émission ultrasonore ultérieure, qui est captée pour former une image. L'avantage unique de, ou Pam, réside dans sa détection sans contact avec le sol et sa sensibilité exquise à l'absorption optique. En revanche, les technologies de microscopie par réflexion, non optiques, existantes sont principalement sensibles à la diffusion optique ou à la fluorescence, capables de fournir un imagerie in vivo, sans marquage et à haute résolution de l'absorption optique. RPM a trouvé des applications biomédicales étendues en neurologie, en ophtalmologie, en biologie vasculaire et en dermatologie.

La microscopie photoacoustique à résolution optique, ou PAMM, comprend des composants optiques et ultrasonores. La source d'irradiation optique est un laser à colorant pompé par un laser pulsé en état solide. Le faisceau laser de sortie est atténué par un filtre neutre et couplé dans une fibre optique monomode pour acheminer la lumière, ce qui permet le balayage mécanique de la tête d'imagerie du microscope plutôt que celui de l'objet vivant, afin de coupler efficacement le faisceau laser multimode dans une fibre optique monomode.

Il est d'abord filtré par un diaphragme de 50 micromètres de diamètre. Le diaphragme est positionné légèrement en dehors du foyer de la lentille de condenseur afin d'ajuster son diamètre au diamètre du faisceau du mode fondamental. Pour créer un foyer optique quasi limité par la diffraction, la sortie de la fibre monomode est collimatée et remplit l'ouverture arrière de l'objectif du microscope.

La détection ultrasonore implique un combinateur acousto-optique fabriqué maison, relié à un transducteur ultrasonore. Le combinateur aligne de manière coaxiale l'irradiation optique et la détection acoustique. Une cavité sphérique est usinée au fond du combinateur afin de former une lentille acoustique ayant une ouverture numérique de 0,5 dans l'eau, ce qui fournit un diamètre focal acoustique de 43 micromètres à la fréquence centrale de 50 mégahertz.

Pour le premier alignement, il est utile d'utiliser l'échographie en mode écho-impulsion pour déterminer la position du plan focal acoustique. La tête d'imagerie est ajustée verticalement jusqu'à ce que le signal ultrasonore maximal en écho-impulsion soit observé. Afin de maximiser la sensibilité de détection, les foyers optique et acoustique sont alignés en configuration confocale.

Une cible absorbante optiquement, comme un morceau de ruban adhésif électrique noir, est placée dans le plan focal acoustique. Ensuite, la position focale optique est ajustée afin de maximiser le signal photoacoustique. Le système PAM comprend également des amplificateurs électroniques et un convertisseur analogique-numérique, un scanner mécanique et un contrôleur de scanner.

Le signal numérisé est transféré vers un ordinateur pour la formation d'images. Le logiciel convertit les données brutes en une séquence d'images bcan en coupe transversale. Lorsque la tête du microscope effectue une numérisation en balayage de l'objet, les images enregistrées peuvent ensuite être affichées sous forme d'images individuelles en coupe transversale, d'images projetées en amplitude maximale 2D ou de rendus 3D.

Un réservoir d'eau est utilisé pour loger la tête d'imagerie du microscope. Une fenêtre d'imagerie est découpée dans une boîte de Pétri et scellée avec une membrane en polyéthylène transparente aux ultrasons et à la lumière. L'onde photoacoustique générée par l'objet est couplée acoustiquement au détecteur ultrasonore d'abord par un gel ultrasonore situé entre l'objet et la membrane en polyéthylène, puis par de l'eau déionisée présente dans la boîte de Pétri.

Ces inventions et applications des lasers à optique disponibles et du transducteur ultrasonore constituent le système ou pam. Dans le segment suivant, nous imagerons le microvasculaire d'une souris vivante à l'aide de ce système. Si l'animal à imager n'est pas une souris nue, il est idéal de procéder à la détente 24 heures avant l'expérience.

Ainsi, l'irritation de la vascularisation cutanée est atténuée. Anesthésiez la souris avec des vapeurs de fluorure d'isoflurane à 3 % vaporisées dans de l'oxygène médical. Le débit typique se situe entre un et 1,5 litre par minute.

En fonction du poids corporel de l'animal. Maintenir l'anesthésie avec 1 % d'ISO fluoré tout au long de l'expérience ; effectuer une pression sur l'orteil pour s'assurer que la souris est complètement anesthésiée. Transférer la souris sur un support stéréotaxique muni d'un tapis chauffant afin de maintenir sa température corporelle à 37 degrés Celsius.

Applatissez maintenant l'oreille sur la plaque en plastique. Appliquez ensuite une couche de gel échographique sur l'oreille. Évitez de piéger des bulles d'air dans le gel.

Appliquez également une pommade ophtalmique sur les yeux pour éviter le dessèchement ou tout dommage accidentel causé par le laser. Évitez de toucher directement l'œil avec l'embout applicateur. Ensuite, placez l'oreille sous la fenêtre d'imagerie et relevez lentement la plateforme de l'animal jusqu'à ce que le gel échographique entre en contact avec la partie inférieure de la membrane.

Un contact doux est nécessaire car appuyer l'oreille contre la membrane pourrait affecter la circulation sanguine dans l'oreille. Ensuite, prenez quelques précautions avec l'animal afin de surveiller son état physiologique. Fixez un oxymètre de pouls à la patte ou à la queue de la souris.

Abaissez maintenant la tête d'imagerie jusqu'à ce que la lentille acoustique soit immergée dans de l'eau déionisée et retirez les bulles piégées sous la lentille acoustique. Réglez le laser en mode déclenchement externe et commencez un balayage d'essai. Ajustez la position en Z de la tête d'imagerie jusqu'à ce que les foyers optique et acoustique soient positionnés au milieu de l'oreille.

Paramétrez maintenant les paramètres de balayage et démarrez l'acquisition formelle des images. Pour mesurer la concentration totale en hémoglobine, réglez la longueur d'onde sur un point isosbestique où les coefficients d'extinction molaire de l'oxyhémoglobine et de la dés oxyhémoglobine sont égaux.

Pour mesurer la saturation en oxygène de l'hémoglobine, réglez la deuxième longueur d'onde à une valeur où les coefficients d'extinction molaire de l'oxyhémoglobine et de la désossyhémoglobine présentent une différence marquée. Une fois terminé, nettoyez l'oreille de la souris et placez-la dans un incubateur. Avec une température ambiante réglée à 37 degrés Celsius, lorsque la souris se réveillera, ramenez-la naturellement au vivarium.

Cette image de projection d'amplitude maximale montre l'anatomie vasculaire de l'oreille d'une souris nue vivante, obtenue à l'aide de Pam à 570 nanomètres. Cette image de projection montre la saturation en oxygène de l'hémoglobine dans la même oreille. Elle est calculée à partir des images acquises à une longueur d'onde isobestique de 570 nanomètres et à une longueur d'onde dominante pour l'absorption de la désoxyhémoglobine de 561 nanomètres.

Un examen plus attentif de la région encadrée montre la résolution de l'oramm. Un lit capillaire densément compacté est clairement résolu. Dans cette vidéo, nous avons démontré le protocole expérimental typique pour l'ORPM, incluant la configuration du système, l'alignement du système, la procédure expérimentale in vivo et le schéma d'imagerie fonctionnelle.

Un des aspects les plus importants dans la conception et le fonctionnement de l'instrument est l'alignement confocal opto-acoustique, qui est crucial pour la sensibilité d'imagerie, la résolution optique de la microscopie photoacoustique combinée à la microscopie photoacoustique à résolution acoustique profonde et à la tomographie photoacoustique assistée par ordinateur, offrant des perspectives d'imagerie fonctionnelle, moléculaire et in vivo à plusieurs échelles, allant des ongles d'organes, des cellules, des tissus jusqu'aux organes entiers, tous visualisés avec le même contraste. Cette origine, telle que l'évolutivité de l'imagerie, détient le potentiel de révolutionner la recherche dans les systèmes biologiques multi-échelles et la translation, des découvertes de laboratoire microscopiques à la pratique clinique macroscopique.