Détermination des structures moléculaires des glycoprotéines d'enveloppe du VIH en utilisant microscopie cryo-électronique et automatisée Sous-tomogramme moyenne

Plus de 60 millions de personnes ont été infectées par le VIH, le virus responsable du sida. Le VIH/sida constitue une crise sanitaire mondiale, et bien que des efforts de recherche intensifs aient considérablement prolongé la vie des personnes infectées, un vaccin véritable reste insaisissable. Un axe majeur de la recherche sur le vaccin contre le VIH concerne la glycoprotéine de l’enveloppe, que le VIH utilise pour pénétrer dans les cellules cibles.

Dans cette vidéo, nous démontrons comment nous obtenons les structures de cette protéine importante à l’aide d’une technique d’imagerie appelée tomographie électronique cryogénique. À partir du VIH purifié, nous présentons les étapes de préparation des échantillons congelés, les étapes d’acquisition d’images en microscopie électronique sur ces échantillons congelés, ainsi que les étapes de transformation de ces images en modèles structuraux pouvant être utiles pour la conception de vaccins contre le VIH/sida. Un aspect particulier de ce que nous présentons dans cette vidéo est que les travaux seront réalisés par des membres de son laboratoire, couvrant un large éventail d’âges, allant d’élèves du collège et du lycée à des étudiants universitaires et des diplômés, jusqu’à des chercheurs postdoctoraux et des scientifiques confirmés.

La préparation d'échantillons de virus vitrifiés adaptés à la tomographie électronique cryogénique consiste à déposer une suspension aqueuse de virus sur de petits trous présents dans un film de carbone supporté par une grille en cuivre, puis à congeler rapidement les virus. L'objectif de cette étape est d'obtenir un échantillon congelé de virus intacts, figés dans un état proche de leur état natif. Pour commencer, les grilles sont placées à l'intérieur d'une unité de décharge luminescente.

Cet appareil nettoie les grilles en les exposant à un gaz ionisé. Maintenant que les grilles sont prêtes à être utilisées, une suspension de virus mélangée à de petites particules d'or est préparée. Ces particules sont essentielles à la collecte et au traitement des données.

Ensuite, une goutte de suspension virale est déposée sur la grille fraîchement nettoyée au plasma. La grille est ensuite chargée dans un robot, qui l'essuie à l’aide de papier filtre, réduisant la goutte en un fin film liquide. L’échantillon est alors plongé dans de l’éthane liquide, qui congèle rapidement les virus à une vitesse dépassant 100 000 kelvins par seconde.

La grille plongée dans l'azote liquide est ensuite transférée dans une boîte de stockage pour être transportée vers le microscope. Cette opération est répétée jusqu'à ce que le nombre souhaité de grilles soit congelé. Maintenant que les grilles d'échantillons viraux sont prêtes, l'étape suivante consiste à les charger dans le microscope.

Pour l'imagerie, cela peut être fait manuellement ou à l'aide d'une assistance robotique. Lorsque les grilles d'échantillons sont chargées manuellement, l'utilisateur est assis à une station spécialisée où les échantillons peuvent être manipulés sous azote liquide ; les échantillons sont placés dans une chambre portable refroidie à l'azote, qui est scellée, évacuée, puis fixée au microscope. Les microscopes plus récents sont capables d'un chargement d'échantillons plus automatisé.

Ici, dans un microscope cryo-Titan, les échantillons congelés sont remis à l'appareil par l'utilisateur, puis chargés robotiquement avec les grilles d'échantillons placées dans le microscope. Chaque grille peut être examinée par l'utilisateur avant le début de l'acquisition d'images. Les paramètres du microscope sont configurés pour chaque zone de la grille d'échantillon présentant des caractéristiques d'intérêt.

Dans ce cas, les éléments concernés sont les virus du VIH. À mesure que chaque nouvelle zone est définie, l'ordinateur du microscope enregistre les paramètres d'imagerie spécifiques à cette zone. Lorsque l'utilisateur a défini toutes les positions d'intérêt, l'ordinateur revisite automatiquement chaque position et collecte un jeu de données.

Chaque jeu de données est recueilli en inclinant la grille d'échantillon par rapport au faisceau d'électrons, tout en veillant à ce que le faisceau reste focalisé sur le même point de la grille. La collecte de données en microscopie électronique a traditionnellement exigé que les utilisateurs restent près du microscope et interagissent physiquement avec l'appareil. Ce mode d'interaction avec le microscope est illustré ici lors d'une visite du président Obama dans une usine d'Intel.

Les récents progrès dans les interfaces informatiques des microscopes permettent désormais aux utilisateurs de surveiller et d'ajuster en temps réel la collecte de données depuis un ordinateur distant, que ce soit dans le laboratoire ou ailleurs. Afin de visualiser les formes de l'enveloppe et des protéines spike, les informations provenant de centaines d'images individuelles doivent être moyennées pour renforcer le signal. Ce processus, intensif en calcul, est réalisé ici à l'aide d'un cluster d'ordinateurs appelé Bio Wolf.

Situé au NIH, des méthodes puissantes ont été mises au point pour extraire des volumes individuels et moyenne les informations à l'aide d'algorithmes capables de fonctionner à des niveaux de bruit élevés. Intrinsèques à ce type de données, les cartes de densité obtenues à partir de virus natifs et de virus formant des complexes avec des molécules biologiquement importantes fournissent une base de données riche en informations sur la biologie structurale du VIH. Les cartes de densité prennent vie avec un détail moléculaire lorsque les données sont combinées à celles provenant de la cristallographie aux rayons X des sous-unités individuelles constituant la protéine virale d'enveloppe.

Les données issues de ces tomographies peuvent être très denses et difficiles à interpréter. Des logiciels 3D utilisés dans l'industrie du divertissement permettent de visualiser les modèles tridimensionnels en ajoutant des couleurs, des textures et des effets d'éclairage, ce qui facilite leur analyse. Les logiciels de visualisation couramment utilisés incluent Mirror 3D Studio Max et Maya.

Nous venons de démontrer étape par étape les procédures permettant d'obtenir des modèles moléculaires de la structure de la glycoprotéine de l'enveloppe, à partir du VIH purifié. À l'aide de cette méthode, nous avons également déterminé les structures de la glycoprotéine de l'enveloppe en complexe avec diverses molécules capables de se lier au virus et de l'utiliser.

Ici, nous présentons un exemple de la structure de la glycoprotéine d'enveloppe en complexe avec un anticorps appelé B12. Comprendre pourquoi certaines molécules peuvent se lier au virus et l'utiliser, tandis que d'autres ne le peuvent pas, est très important pour la conception rationnelle de vaccins. La détermination des structures moléculaires des glycoprotéines d'enveloppe du VIH ou d'autres virus, tels que la grippe et Ebola, est essentielle pour comprendre l'entrée virale et son exploitation.

Comme vous l'avez vu, la tomographie électronique cryogénique émerge désormais comme un outil puissant pour atteindre cet objectif.