Quantifier la fréquence des tumeurs se propageant Cellules utilisant Limiter la greffe de cellules syngéniques de dilution dans Zebrafish

Le test de transplantation cellulaire par dilution limite est la norme de référence pour évaluer le potentiel d'auto-renouvellement dans les modèles animaux expérimentaux. Dans cette démonstration, des embryons de poisson zèbre syngéniques au stade unidéterminé sont injectés avec rag deux MIC et RAG deux GFP afin de créer des poissons zèbres transgéniques qui développeront une leucémie lymphoblastique aiguë T marquée de façon fluorescente. À 60 jours de vie, les cellules leucémiques primaires sont isolées à partir des poissons zèbres, puis purifiées par tri cellulaire activé par fluorescence.

Ensuite, les cellules sont transplantées en dilution limitante dans la cavité péritonéale de poissons-zèbres adultes, et les poissons sont surveillés pendant jusqu'à 90 jours pour détecter la croissance tumorale. Enfin, le logiciel statistique d'analyse en dilution extrême est utilisé pour quantifier la fréquence des cellules propagatrices de leucémie au sein de la tumeur initiale. L'analyse par transplantation de cellules en dilution limitante permet aux chercheurs d'évaluer précisément le nombre de cellules à renouvellement propre présentes dans la masse tumorale globale.

Ce sont ces cellules autorénewables qui favorisent la formation du cancer et sont en fin de compte responsables des rechutes. Le principal avantage de la réalisation de tests de transplantation en dilution limitante dans le modèle du poisson zèbre est que de nombreux poissons peuvent être transplantés pour chaque expérience, ce qui permet une meilleure précision lors de la détermination de la fréquence des cellules tumorales propagatives autorénewables. Cette méthode fournit des informations sur les cellules tumorales propagatives dans la leucémie lymphoblastique aiguë à cellules T.

Il peut également être appliqué pour étudier d'autres modèles de cancer chez le poisson zèbre. Jessica Blackburn, chercheuse postdoctorale dans le laboratoire, et Sally Liu, une technicienne talentueuse, vont vous démontrer la procédure aujourd'hui. Pour linéariser les constructions Rag two CM et RAG two G-F-P-D-N-A, digérez 10 microgrammes de chaque plasmide avec l'enzyme de restriction not one à 37 degrés Celsius pendant toute la nuit. Après une extraction au phénol-chloroforme et une précipitation à l'éthanol, nous suspendons chaque plasmide dans 20 microlitres d'eau.

Déterminez les concentrations d'ADN sur un gel d'agarose à 1 % en réalisant une dilution un-à-un, un-à-cinq et un-à-dix de chaque plasmide digéré avec respectivement 20 microlitres, 10 microlitres et 5 microlitres d'une échelle d'ADN à grande gamme. Diluez ensuite l'ADN à une concentration finale de 60 nanogrammes par microlitre pour injection dans la souche CG un syngène. Injectez 250 nanolitres de 30 nanogrammes par microlitre de rag deux CM et 30 nanogrammes par microlitre dans des embryons de poisson zèbre.

Injecter deux GFP dans des embryons de zebrafish au stade unidcellulaire en ciblant soigneusement l'ADN directement dans la cellule et non dans le vitellus. Conserver les embryons injectés à 28,5 degrés Celsius et éliminer les embryons morts après 24 heures ; à cinq jours de vie, transférer les animaux dans de grands aquariums environ 28 jours après l'injection. Anesthésier les larves de zebrafish en ajoutant 200 microlitres de trica S à 4 nanogrammes par millilitre à 25 millilitres d'eau de système pour poissons dans une boîte de Pétri.

Examinez les larves pour détecter le développement du LAM marqué par fluorescence en utilisant un microscope à fluorescence en épifluorescence afin de visualiser la fluorescence de la GFP. Séparez les larves positives au tumor des larves négatives afin de s'assurer qu'aucun poisson leucémique n'est oublié lors de l'analyse. Les larves négatives peuvent être examinées à un moment ultérieur, une fois que les tumeurs ont pu grossir. Surveillez les poissons leucémiques marqués par fluorescence au moins une fois par semaine à l'aide du microscope à fluorescence en épifluorescence afin de suivre la croissance tumorale.

Lorsque les cellules leucémiques GFP positives ont envahi plus de 50 % de l'animal, ajoutez un millilitre de quatre nanogrammes par millilitre de Trica S dans une boîte de Pétri contenant neuf millilitres d'eau de système pour poissons afin d'euthanasier le poisson. Placez le poisson dans une nouvelle boîte de Pétri contenant un millilitre de 5 % de sérum bovin fœtal dans du PBS 0,9 X. Macérez le poisson avec une lame de rasoir, puis pipetez le mélange pour dissocier les gros agrégats cellulaires. Ensuite, faites passer les cellules à travers un tamis de 40 micromètres dans un tube de 50 millilitres.

Prélvez 500 microlitres des cellules et transférez-les dans un tube en polystyrène de quatre millilitres. Ajoutez un microlitre de solution d’iodure de propidium à un milligramme par millilitre afin de marquer les cellules mortes, vortexez, puis maintenez les cellules sur de la glace. Préparez également un poisson sauvage CG1 pour recueillir des cellules sanguines normales, qui serviront de vecteur aux cellules tumorales lors de la greffe, en ajoutant quatre millilitres de FPS à 5 % dans du PBS 0,9 X dans un tube de 50 millilitres, pour un volume total de cinq millilitres.

Compter les cellules sanguines normales diluées à trois fois 10 à la puissance 5 cellules par millilitre dans du PBS 0,9 % contenant 5 % de FBS, puis pipeter 100 microlitres par puits d'une plaque 96 puits à l'aide d'un trieur cellulaire activé par fluorescence afin de trier les cellules tumorales GFP positives et PI négatives dans la plaque 96 puits contenant les cellules sanguines aux doses indiquées. En outre, trier 10 000 cellules dans un puits sans cellules sanguines normales et réanalyser à l'aide de FACS pour évaluer la pureté et la viabilité des cellules triées. Centrifuger la plaque 96 puits à 2000 ×g pendant 10 minutes pour former un culot cellulaire.

Retirer 95 microlitres du surnageant et resuspendre les cellules dans les cinq microlitres restants. Injecter la suspension cellulaire dans la cavité péritonéale de poissons-zèbres syngéniques adultes âgés de plus de 60 jours à l’aide d’une microsyringe de calibre 26 et demi. Les poissons-zèbres n’ont pas besoin d’être anesthésiés avant la greffe.

Transplanter 45 poissons avec 10 cellules leucémiques, 20 poissons avec 100 cellules, sept poissons avec 1000 cellules et cinq poissons avec 10 000 cellules TALL environ 28 jours après la transplantation. Examiner les poissons zèbres récipients à l’aide d’un microscope à fluorescence épifluorescence en utilisant une longueur d’onde d’excitation de 485/20 et un filtre d’émission de 530/25 pour détecter la fluorescence GFP.

Enregistrer le nombre de poissons positifs par rapport au nombre total de poissons injectés. Réexaminer les poissons toutes les 14 jours pendant une période allant jusqu'à 90 jours et noter le nombre de poissons positifs. Lorsqu'un poisson présentant une tumeur devient plus abondant.

Sacrifier l'animal par une surdose de trica US, saisir les résultats dans un tableau et téléverser les données dans le logiciel d'analyse web de dilution extrême en limites afin de déterminer la fréquence des cellules leucémiques autorépliquantes au sein des embryons primaires de la souche TALL CG. Les embryons ont été injectés avec RAG deux cmic et les larves RAG deux GFP ont été criblées pour détecter la présence de TALL primaire. Après 28 jours, conformément aux travaux antérieurs, environ 5 % des poissons injectés présentent des lymphocytes T GFP positifs dans leur thymus, et 100 % de ces poissons développeront une leucémie. Ici, des cellules TALL marquées par fluorescence ont été triées à partir d'animaux malades âgés de 65 jours et utilisées dans le test de transplantation cellulaire par dilution limitante. Premièrement, une fenêtre de sélection a été tracée afin de choisir les cellules uniques.

Ensuite, les cellules négatives au iodure de propidium ont été sélectionnées. Et finalement, un quadrillage a été défini afin de sélectionner uniquement les cellules leucémiques positives pour la GFP en vue du tri. Dans cet exemple de poisson transplanté avec une TALL au jour 28, des tumeurs au stade précoce étaient visibles sous forme d'une zone de cellules positives pour la GFP près du site d'injection.

Bien que certaines LST soient plus avancées, s'étant développées jusqu'à envahir la cavité péritonéale pour ces expériences, plus de 220 animaux ont été transplantés, ce qui peut être facilement réalisé par une seule personne en quelques heures. L'analyse des données à l'aide du logiciel elda a montré qu'en moyenne, une cellule T sur 135 était une cellule leucémique à renouvellement propre et propagatrice de la tumeur. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment transplanter des cellules tumorales en dilution limitante dans la cavité péritonéale de zebrafish syngéniques, ainsi que la manière d'utiliser les données obtenues pour déterminer la fréquence des cellules propagatrices de tumeur au sein d'une tumeur donnée.

Des études supplémentaires utilisant des animaux génétiquement modifiés pourraient aider à identifier les mécanismes régissant l'auto-renouvellement de ces cellules propagatrices de tumeurs.