Analyse mosaïque de fonction des gènes dans le développement de cerveau de souris à l'aide postnatale à base de virus recombinaison Cre

L'objectif général de cette procédure est de manipuler la fonction des gènes pendant la période postnatale du développement cérébral. Cela est réalisé en sélectionnant et en préparant d'abord les virus appropriés, en les chargeant dans la seringue et en préparant le matériel d'injection. Ensuite, le virus est injecté dans le cerveau de souriceaux nouveau-nés, et la dernière étape consiste à sacrifier les animaux et à imager les régions injectées.

En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent une étiquetage différentiel des cellules contrôles et des cellules invalidées par microscopie immunofluorescente. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, comme la manière dont la période de développement postnatal est régulée génétiquement. Pour l'injection, une solution virale adéno-associée disponible dans le commerce peut être utilisée à titre complet, typiquement 10 à la puissance 12 copies génomiques par millilitre, afin de manipuler un grand nombre de cellules.

Si une dilution faible ou un marquage est souhaité, commencez par une dilution de un à dix. Après décongélation du virus sur de la glace, transférez immédiatement le volume de pré-dilution dans un tube PCR stérile de 250 microlitres. Conservez la dilution sur de la glice.

Préparez la pompe d'injection en sélectionnant une seringue appropriée et en la connectant à une aiguille de chargement. Ensuite, aspirez doucement la solution virale jusqu'à ce qu'une très petite bulle d'air soit visible dans la seringue ; un colorant de chargement inerte peut être utilisé pour faciliter cette étape. Fixez maintenant la seringue à la pompe à l'aide d'un dispositif de retenue.

Fixez ensuite délicatement un tube de raccordement entre la seringue et le porte-aiguille. Veillez à ce que l'aiguille d'injection soit en contact direct avec le tube de raccordement à l'intérieur du porte-aiguille. Faites maintenant progresser lentement la solution à travers le tube de raccordement jusqu'à ce qu'une petite goutte de solution soit visible à l'extrémité de l'aiguille.

Fixez soigneusement le piston à côté du bloc poussoir à l'aide d'un support sur la pompe. Réglez le débit d'injection à huit microlitres par minute et fixez le volume d'injection entre un et deux microlitres. Réglez ensuite le diamètre de la seringue sur la pompe afin qu'il corresponde au diamètre de la seringue utilisée.

Enfin, pour protéger les souriceaux pendant la phase de récupération, régler le bloc chauffant à 38 degrés Celsius et le recouvrir d'une serviette en papier. Selon un protocole approuvé par l'IACUC, préparer des souriceaux âgés de P zéro ou P un pour injection en les soumettant à une anesthésie par le froid. Humidifier quelques serviettes en papier avec de l'eau et les placer sur de la glace.

Ensuite, placer quatre ou cinq souriceaux sur la serviette en papier bien espacés. Replier délicatement la serviette en papier sur les souriceaux, déposer une petite quantité de glace pilée sur le dessus de la serviette en papier et incuber les souriceaux pendant environ cinq minutes. Les souriceaux peuvent être conservés en toute sécurité sur de la glace jusqu'à 15 minutes et présenter tout de même une bonne récupération.

Placez maintenant un raton anesthésié sur un bloc de montage pour un accès optimal au site d'injection. Par exemple, le cortex est le plus facilement accessible en plaçant l'animal à plat sur le ventre. Le raton peut être maintenu en place à l'aide d'un pansement adhésif ; stabilisez manuellement la tête du raton et tendez la peau pour éviter tout mouvement.

Ensuite, repérez les repères anatomiques du crâne tels que la suture lambda, sélectionnez un point d'injection reproductible avec l'autre main, puis insérez délicatement l'aiguille à travers le crâne. N'appuyez pas fort si l'aiguille ne pénètre pas facilement le crâne. Au lieu de cela, repositionnez l'aiguille et essayez à nouveau délicatement.

La profondeur d'injection varie légèrement entre les animaux et les souches pour le cortex ; une profondeur comprise entre un demi-millimètre et un millimètre fonctionne généralement. Injectez maintenant la solution virale en demandant à un collègue d'activer la pompe afin de minimiser les mouvements de main. Idéalement, une pédale au pied pourrait être utilisée pour démarrer la pompe après l'injection.

Gardez l'aiguille en place pendant quelques secondes, tout en maintenant la tête du petit immobile de manière lisse. Retirez lentement l'aiguille. Laissez maintenant le petit se remettre pendant cinq à dix minutes sur la plaque chauffante recouverte.

Pendant ce temps, continuez à injecter les autres petits. Lorsque tous les petits ont retrouvé leur couleur rose et qu'ils bougent tous, frottez-les doucement avec une partie de leur litière d'origine. Ce n'est qu'alors qu'ils peuvent être rendus à leur mère.

Dans le cas contraire, ils pourraient être considérés comme des petits inconnus, que la mère tuerait très probablement après leur retour auprès d'elle. Nettoyez le dispositif d'injection en chargeant entièrement la seringue avec de l'acétone ou de l'éthanol à 70 %. Si des composants sensibles à l'acétone, tels que le sano, l'acurate ou des adhésifs, sont utilisés, faites circuler la solution à travers le dispositif d'injection plusieurs fois en utilisant à chaque fois une solution fraîche.

Cela éliminera toute solution virale résiduelle et les précipités, tandis que les solvants s'évaporeront. Après avoir purgé le dispositif, désinfectez la zone de travail avec de l'eau de Javel afin de la laisser prête pour le prochain expérimentateur. Mentor. Une technique réussie produit une infection neuronale robuste au site d'injection.

Les injections dans des régions spécifiques telles que le cortex et le colliculus supérieur génèrent généralement des infections localisées avec une diffusion minimale vers les régions adjacentes. L'utilisation d'une solution virale de haut titre rend plus probable l'infection de zones adjacentes telles que l'hippocampe, par rapport à une injection avec une solution virale de faible titre. Les résultats montrent une infection clairsemée, typiquement proche du site d'injection, comme dans le cas d'une injection cérébelleuse sur la ligne médiane ; le nombre de cellules infectées devrait corréler avec le titre de la solution virale injectée.

Par exemple, l'injection d'un mélange de solutions à haut titre de deux virus AAV8 exprimant différentes protéines fluorescentes dans le cervelet permet d'infecter de nombreuses cellules kinji qui sont marquées de façon différentielle. Inversement, l'injection d'une solution virale à faible titre peut entraîner une infection clairsemée, facilitant ainsi la visualisation de cellules individuelles. Les neurones marqués de façon fluorescente peuvent être observés directement dans des tissus vivants fraîchement coupés, ou bien être soumis à une immunomarquage.

Cela améliore les signaux fluorescents endogènes en vue de l'acquisition ultérieure d'images par microscopie fluorescente en champ large ou confocale. Enfin, le RAAV huit est capable d'infester divers types de neurones dans le cortex, avec une marquage intense des processus fins. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ 30 minutes si elle est effectuée correctement.