Bromodésoxyuridine (BrdU) l'étiquetage et ultérieures de tri cellulaire activé par fluorescence de la culture indépendante Identification de carbone organique dissous dégradants bactérioplancton

Les micro-organismes interviennent dans la dégradation de nombreuses substances de carbone organique dissous ou composés C.O.D., comme dans les environnements racinaires et aquatiques. Pour comprendre pleinement le rôle des micro-organismes dans la transformation du C.O.D., une identification simultanée de leur taxonomie et de leur fonction est nécessaire. Cette vidéo présente une procédure permettant l'identification taxonomique de bactéries libres ou de plancton bactérien qui transforment des réserves spécifiques de C.O.D. et d'environnements aquatiques.

Des échantillons d'eau prélevés dans un environnement test sont traités et incubés avec un composé d'intérêt et du bromodésoxyuridine (BRDU), qui s'incorpore dans l'ADN nouvellement synthétisé et dans les cellules en croissance active. Ensuite, le plancton bactérien marqué au BRDU est révélé à l'aide d'anticorps anti-BRDU conjugués au fluorochrome ZI. Le plancton bactérien présentant des taux élevés de marquage au BRDU est isolé par tri cellulaire activé par fluorescence.

L'ADN est ensuite extrait des cellules triées et l'identification taxonomique est réalisée à partir des résultats d'une analyse du gène de l'ARN ribosomique 16 S par PCR. Bonjour, je m'appelle Steven Robbins du laboratoire du Dr Chen Mao du Département des sciences biologiques de l'Université d'État de Kent. Aujourd'hui, lu et moi allons vous présenter une méthode indépendante de culture pour l'identification des bactéries planctoniques dégradant le DOC dans les environnements aquatiques.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les amendements nutritifs suivis d'une analyse de l'ADN des communautés bactériennes, est qu'elle concentre l'analyse sur les bactéries très actives tout en excluant les cellules dormantes et celles à croissance lente. Nous montrons ici l'identification de bactéries associées à la banane plantain qui utilisent un composé spécifique de la matière organique dissoute (DOC). Toutefois, cette méthode peut également être appliquée à l'étude du plancton bactérien utilisant un autre composé unique de DOC ou un groupe de composés organiques dissous, tels que les exsudats algales.

Alors, prélevons quelques échantillons d'eau et commençons. Avant de tester les échantillons d'eau pour les bactéries planctoniques dégradant le DOC, ces échantillons doivent être correctement traités. Les échantillons présentés ici ont été collectés au large de la côte de Géorgie afin d'éliminer les grandes particules et les ER VRE de l'échantillon d'eau.

Utilisez une pompe péristaltique pour transférer l'eau du fût de collecte vers une unité de filtration équipée d'un filtre de taille de pore d'un micromètre. Ensuite, transférez des aliquotes de 36 millilitres du filtrat dans trois tubes stériles en polypropylène de 50 millilitres. Chaque tube contenant quatre millilitres de solution fraîchement préparée de paraformaldéhyde à 10 %. Incubez pendant deux heures à température ambiante afin de préserver les cellules après l'incubation.

Verser l'eau dans la tour de filtration d'une unité de filtration sous vide en verre équipée de filtres membranaires blancs de 0,22 micromètre de diamètre de pore et appliquer le vide pour faire passer la solution à travers. Rincer le filtre en faisant passer 10 millilitres de PBS à travers le filtre sous vide. Étiqueter les filtres comme témoins négatifs et les conserver à moins 20 degrés Celsius.

Pour mettre en place un écosystème expérimental ou un microcosme, commencez par remplir six flacons en verre d’un litre, préalablement rincés, avec 800 millilitres de l’échantillon d’eau préfiltré. Ajoutez du BRDU à chaque microcosme afin d’obtenir une concentration finale de 10 micromolaire. Tournez rapidement le flacon à la main pour homogénéiser.

Chaque échantillon sera analysé en triplicat. Ainsi, ajoutez le composé modèle de DOC à trois des microcosmes. Ici, la reine est ajoutée aux microcosmes à une concentration finale de 100 nanomolaire.

Ensuite, ajouter du PBS stérile aux trois autres microcosmes. Ceux-ci serviront de témoins sans DOC. Placer tous les microcosmes dans un incubateur agité à 100 tr/min, à l'obscurité et à la température in situ, soit 25 degrés Celsius. Effectuer les prélèvements aux points temporels de 0, 8, 16 et 24 heures.

Prélevez 36 millilitres de chaque microcosme dans un tube stérile en polypropylène de 50 millilitres contenant quatre millilitres de paraformaldéhyde frais à 10 %, puis incubez pendant deux heures à température ambiante pour fixer les cellules. Ensuite, filtrez les cellules fixées à travers des membranes blanches de 0,22 micromètre de diamètre de pore. Appliquez 10 millilitres de PBS à travers le filtre sous vide pour éliminer les résidus de PFA.

Procédez immédiatement à la détection immuno in situ INS ou conservez les filtres à moins 20 degrés Celsius pour doser l'incorporation de BRDU dans le plancton bactérien. Commencez par placer les filtres d'échantillons à température ambiante afin d'altérer la paroi cellulaire bactérienne. Placez le filtre sur un dispositif de filtration, puis ajoutez un millilitre de solution de lysozyme sur le filtre afin de recouvrir les cellules et incubez à température ambiante pendant 30 minutes.

Après l'incubation, appliquez un vide pour éliminer la solution. Une fois que la solution a traversé le filtre, lavez les cellules en ajoutant 10 millilitres de PBS et appliquez un vide. Ensuite, pour affaiblir davantage la paroi cellulaire, ajoutez un millilitre de solution de protéinase K sur le filtre afin de recouvrir les cellules.

Incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Laver avec du PBS pour produire de l'ADN en simple brin. Ajouter un millilitre de solution d'exonucléase pour recouvrir les cellules sur le filtre.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après l'incubation, laver le filtre en faisant passer 10 millilitres de PBS à travers le filtre sous vide. Ensuite, découper les bords du filtre pour éliminer la partie qui ne contient pas de cellules.

Ensuite, sur une surface sèche nettoyée à l’alcool, utilisez une lame stérile pour découper le filtre en huit morceaux de taille égale. Huit chambres d'incubation à joint de cadre sont nécessaires pour chaque échantillon ; placez un huitième du filtre dans chaque chambre d'incubation à joint de cadre assemblée, côté échantillon vers le haut. Une fois les chambres assemblées, utilisez le fluide du kit de prolifération cellulaire Roche Intu pour détecter in situ les cellules marquées A-B-R-D-U.

Une fois les procédures habituelles terminées, retirez la section du filtre de la chambre d'incubation et placez-la sur une surface stérile. À l’aide d’un scalpel stérile, découpez la section du filtre en petits morceaux. Transférez les morceaux de filtre dans un tube microcentrifuge de deux millilitres contenant un millilitre de PBS, refermez hermétiquement le tube et scellez-le avec du parafilm. Incubez ensuite le tube dans un incubateur agité à 37 degrés Celsius et 200 tr/min pendant 10 minutes.

Après l'incubation, fixez fermement le tube et agitez-le au vortex à vitesse maximale. Pendant cinq minutes, prélevez le surnageant SUP à l’aide d’une pipette et transférez-le dans un tube stérile en polypropylène de 15 millilitres. Resuspendez ensuite le filtre dans le PBS et répétez les étapes de vortex et d’incubation deux fois supplémentaires, en ajoutant à chaque fois le surnageant au même tube de 15 millilitres pour chaque échantillon.

Conserver les cellules en suspension à quatre degrés Celsius. L’échantillon doit être analysé par cytométrie en flux dans les deux jours. Enfin, trier les cellules afin d’obtenir la population présentant un niveau élevé d’incorporation de BRDU.

Ici, un cytomètre de flux à zone BD FACS et le logiciel correspondant sont utilisés. Une fois les cellules triées, la population enrichie en BrdU peut être analysée afin d'en déterminer l'identité taxonomique. Pour amplifier les gènes de l'ARN ribosomique 16 S de diverses bactéries, des PCR sur filtre sont réalisées : pipetez les cellules triées sur un filtre en membrane de polycarbonate blanc de 0,22 µm de taille de pore, puis mettez en marche la pompe à vide et, à l’aide d’une lame stérile, découpez les bords du filtre dépourvus de cellules.

Divisez le filtre en quatre morceaux de taille égale pour chaque condition, puis placez un seul morceau de filtre dans chacun des trois tubes de réaction PCR, côté cellules tourné vers l'intérieur du tube. Ajoutez 45 microlitres d'eau de qualité PCR. Laissez le morceau de filtre s'immerger complètement dans l'eau.

Ensuite, ajoutez deux pastilles Roche illustra pure T ready to go PCR et vortexez brièvement pour aider à dissoudre les pastilles. Puis ajoutez deux microlitres de chacun des amorces 16 s ARNr, sens et antisens.

Ajouter soit un microlitre de BSA pour aider à absorber les inhibiteurs d'amplification, soit un microlitre d'eau. Réaliser l'amplification PCR sur un thermocycleur. Un programme PCR en dégression de température est recommandé, avec une température d'hybridation qui diminue séquentiellement de 62 à 52 degrés Celsius d'un degré Celsius par cycle, suivi de 15 cycles à 52 degrés Celsius.

Confirmer l'amplification par PCR par électrophorèse sur des gels d'agarose à 1 % colorés au bromure d'éthidium, exciser les amplicons PCR à partir du gel et les purifier à l'aide d'un kit d'extraction rapide de gels KaiGen cayo. Après la purification sur gel PCR, regrouper les amplicons du même échantillon. Les amplicons d'ADN ribosomique 16 s purifiés sont désormais prêts pour diverses analyses moléculaires.

Des échantillons ont été prélevés sur un site côtier de Géorgie et traités afin d'étudier les bactéries dégradant la racine selon les procédures décrites dans cette vidéo. La racine est un composé polyamore qui peut être omniprésent dans les environnements marins. Elle peut servir de source de nutriments et d'énergie pour les bactéries marines, comme illustré ici.

L'analyse FACTS des échantillons a révélé qu'après une incubation de 24 heures, un groupe de bactéries présentant un niveau plus élevé d'intensité de fluorescence FXI, corrélée positivement au degré d'incorporation de BRDU, s'était développé dans les microcosmes amendés avec Racine. Ces cellules ont été désignées comme des cellules à forte incorporation de BRDU ou HI et devaient contenir principalement des bactéries dégradant Racine. Pas de hi.

Des cellules ont été observées dans les témoins sans ajout, qui ne contenaient que des cellules présentant des taux plus faibles d'incorporation de BRDU, appelées cellules lii, censées principalement contenir du plancton bactérien incapable d'utiliser. Les cellules Racine HI ajoutées ont été triées dans des tubes séparés, puis collectées sur des filtres membranaires. Des amplicons partiels du gène ARN ribosomique 16S ont été obtenus après PCR sur filtre et confirmés par électrophorèse sur gel.

Après le tri par filtration, une amplification par PCR des gènes fonctionnels peut également être réalisée afin d'examiner la diversité fonctionnelle parmi les cellules triées. Nous venons de vous montrer comment séparer physiquement et identifier des cellules bactériennes fonctionnelles dans un environnement aquatique, en combinant le tri cellulaire activé par fluorescence et l'incorporation de BRDU. N'oubliez pas que le port d'une blouse de laboratoire, d'une blouse protectrice et de gants est obligatoire lors de la réalisation de cette procédure.

Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.